四氯苯醌誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的炎性有關(guān)信號(hào)通路分析.pdf

1、五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有機(jī)污染物，具有致畸、致癌、致突變性質(zhì)，嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)身體健康。盡管二者在環(huán)境中化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，但仍然可以降解生成其他代謝產(chǎn)物。六氯苯可以通過(guò)細(xì)胞色素 P450途徑代謝生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氫醌(TCHQ)，五氯酚則可以通過(guò)鞘氨醇桿菌代謝為四氯苯醌，然后進(jìn)一步還原成四氯氫醌。在這些代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量ROS，破壞生物體內(nèi)的氧化還原平衡，導(dǎo)致毒性效應(yīng)的發(fā)生，如遺傳毒性、肝

2、毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性等。
　　隨著人口老齡化現(xiàn)象地加重，許多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐漸增高。引起這些疾病的因素很多，包括環(huán)境、基因及老齡化等相關(guān)內(nèi)源性因素，但基本可以概括為由于氧化應(yīng)激的產(chǎn)生導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥形成。近幾年來(lái)，關(guān)于六氯苯和五氯酚的神經(jīng)毒性研究已經(jīng)很多，但是關(guān)于四氯苯醌的神經(jīng)毒性，特別是炎癥病理機(jī)制的研究資料卻很少見(jiàn)。探討四氯苯醌誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制，可以為有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防

3、和治療提供新思路。因此，本文選用PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，設(shè)想它引起的炎癥毒性與ROS的產(chǎn)生有關(guān)，做了以下兩部分實(shí)驗(yàn)。
　?。ㄒ唬┧穆缺锦せ領(lǐng)KK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　本實(shí)驗(yàn)旨在比較六氯苯、五氯酚、四氯氫醌和四氯苯醌四種化合物對(duì) PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性、ROS產(chǎn)量、促炎癥因子表達(dá)的作用，然后進(jìn)一步探討四氯苯醌激活NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制。首先利用CCK-8實(shí)驗(yàn)，比較了四種化合物在不同濃度、不同時(shí)間條件

4、下的細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種化合物的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)性增加，并且與ROS的形成密切相關(guān)，其中TCBQ和TCHQ毒性強(qiáng)于PCP、HCB。從DCFH-DA探針檢測(cè)ROS水平及免疫印跡檢測(cè)促炎癥因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)TCBQ和TCHQ對(duì)ROS和促炎癥因子的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于HCB和PCP。接著用免疫印跡和 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)手段從濃度梯度上考察了四氯苯醌誘導(dǎo)IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)炎癥蛋白的表達(dá)情況及促炎癥因子的mRNA水平

5、，及采用NF-κB特異性抑制劑PDTC考察了TCBQ誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TCBQ可以誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，還可以提高促炎癥因子的mRNA水平，PDTC則明顯抑制TCBQ誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)錄及其與目的基因結(jié)合的活性?？寡趸瘎㎞AC、維生素E和姜黃素可以清除TCBQ作用細(xì)胞產(chǎn)生的ROS，還可以部分抑制IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，這說(shuō)明ROS在IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的活化中

6、扮演著重要角色。
　?。ǘ┩屎谒剞卓顾穆缺锦せ頗MGB1/TLR4/MyD88信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)；關(guān)于HMGB1/TLR4/MyD88在炎癥研究中的重要性，很多文獻(xiàn)都有介紹；褪黑素是松果體分泌的一種激素，為強(qiáng)大的內(nèi)源性抗氧化劑，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用?；谝陨先c(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)把TCBQ、褪黑素、HMGB1/TLR4/MyD88三者聯(lián)系起來(lái)，對(duì)它們的相互作用機(jī)

7、制進(jìn)行了探討。
　　首先利用CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選了褪黑素減緩 TCBQ細(xì)胞毒性的最適給藥濃度，最終我們選用200μM褪黑素預(yù)處理細(xì)胞1h，再給予25μM TCBQ培養(yǎng)細(xì)胞6 h進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn)研究。用免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)考察了TCBQ對(duì)TLR4、MD2、CD14、MyD88的影響，還考察了褪黑素在這個(gè)過(guò)程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) TCBQ可以誘導(dǎo)TLR4、MD2、CD14、MyD88的蛋白表達(dá)，TLR4和MyD88的

8、mRNA水平上升，及促進(jìn)TLR4與其適配器MD2、CD14、MyD88的結(jié)合，然而褪黑素抑制了TLR4和其適配器的表達(dá)，還抑制了它們的相互結(jié)合作用。接著也考察了褪黑素對(duì)TCBQ誘導(dǎo)的MAPKs活性的影響，及對(duì)下游炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示褪黑素可以逆轉(zhuǎn)TCBQ對(duì)MAPKs活性的誘導(dǎo)作用。用TLR4 siRNA、MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞觀(guān)察蛋白表達(dá)情況，用TLR4敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)觀(guān)察小鼠腦部切片的HE染色、免疫組化和免疫熒光

9、圖，發(fā)現(xiàn)TCBQ在TLR4和MyD88基因缺陷的情況下，炎癥損傷明顯降低，這強(qiáng)調(diào)了TLR4信號(hào)途徑在TCBQ誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的重要作用。
　　接著我們探討了TCBQ是如何激活TLR4信號(hào)通路的。通過(guò)免疫熒光、免疫印跡及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證明TCBQ可以使HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生乙?；土姿峄揎?，隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，釋放到培養(yǎng)基里。用免疫印跡、免疫熒光、RT-qPCR和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)考察了TCBQ在HMGB1和其受體中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T

10、CBQ可以誘導(dǎo)HMGB1及其受體（TLR2、TLR4、TLR9、RAGE）的表達(dá)，及促進(jìn)HMGB1與其受體的結(jié)合，在這些受體中，HMGB1與 TLR4的作用最強(qiáng)。接著通過(guò)蔗糖密度梯度分離實(shí)驗(yàn)，將裂解液分成12個(gè)片段，再利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCBQ、HMGB1和LPS可以誘導(dǎo)TLR4/MD2向脂筏區(qū)域募集，褪黑素作為抗氧化劑跟NAC、脂筏抑制劑(β-環(huán)糊精和制霉菌素)顯示相同的結(jié)果，這說(shuō)明了ROS參與了TCBQ誘導(dǎo)TLR4向脂筏轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程