有髓鞘神經(jīng)纖維在激痛點(diǎn)所致肌筋膜疼痛綜合征中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分大鼠股二頭肌激痛點(diǎn)定位方法及神經(jīng)纖維分布的相關(guān)研究
　　研究背景：
　　肌筋膜疼痛綜合征(Myofascial pain syndrome，MPS)是一類常見(jiàn)的疼痛綜合征，以激痛點(diǎn)(myofascial trigger points，MTrPs)的出現(xiàn)為特征。激痛點(diǎn)是肌緊張帶中的痛性易激惹小點(diǎn)，直徑約為1～2毫米，受到按壓、針刺等刺激時(shí)產(chǎn)生局部抽搐反應(yīng)、牽涉痛、自發(fā)性電活動(dòng)等。激痛點(diǎn)會(huì)造成受累肌肉肌束縮短、肌力減弱，

2、從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)度受限等運(yùn)動(dòng)功能異常。
　　幾乎每人都有激痛點(diǎn)，可出現(xiàn)于全身任意肌肉組織中，但現(xiàn)在對(duì)于激痛點(diǎn)的成因仍然存在許多爭(zhēng)議。學(xué)者們提出幾種理論，其中比較著名的是能源危機(jī)理論（整合理論）及對(duì)其做出進(jìn)一步補(bǔ)充的Cinderella假說(shuō)，認(rèn)為肌肉勞損導(dǎo)致局部能量危機(jī)、神經(jīng)活性物質(zhì)釋放增多并最終使外周傷害性感受器敏化，造成痛覺(jué)過(guò)敏。另一種理論——神經(jīng)肌肉接頭功能障礙理論認(rèn)為激痛點(diǎn)由許多運(yùn)動(dòng)或感覺(jué)相關(guān)小區(qū)域組成，這些小區(qū)域各自對(duì)激痛

3、點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)或感覺(jué)特征負(fù)責(zé)。
　　現(xiàn)有關(guān)于激痛點(diǎn)的研究多為人體實(shí)驗(yàn)，鑒于有些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，特別是有創(chuàng)性操作，很難在人體實(shí)驗(yàn)開(kāi)展，所以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是十分必要的。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多通過(guò)同一部位反復(fù)擊打、離心運(yùn)動(dòng)等來(lái)誘發(fā)激痛點(diǎn)?？紤]到這些措施多為傷害性操作，可能會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾（如反復(fù)多次擊打等操作本身即可誘發(fā)相應(yīng)脊髓層面的中樞敏化，而且會(huì)造成局部肌纖維損傷）。另外有學(xué)者使用局部注射藥物的方式來(lái)誘發(fā)激痛點(diǎn)，但注射操作及藥物可能對(duì)局部微環(huán)境造成改

4、變。因此，需要一種更加準(zhǔn)確的激痛點(diǎn)動(dòng)物模型來(lái)更好的模擬人體激痛點(diǎn)。此外，在人體實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)詢問(wèn)受試者有無(wú)局部疼痛（特別是可辨認(rèn)的與既往疼痛相似者）的主觀體驗(yàn)來(lái)協(xié)助確定激痛點(diǎn)。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，很難通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主觀體驗(yàn)來(lái)定位，僅能通過(guò)其疼痛避縮反應(yīng)來(lái)衡量疼痛，卻無(wú)法判斷疼痛是否之前即存在，而且無(wú)法判斷是否有牽涉痛的存在。因此，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，需要有更加可靠的激痛點(diǎn)定位方法。
　　既往研究顯示激痛點(diǎn)處有痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏現(xiàn)象。同

5、時(shí)有學(xué)者使用鐵沉積法發(fā)現(xiàn)激痛點(diǎn)處有更多的神經(jīng)纖維末梢存在。有臨床報(bào)道指出有髓鞘神經(jīng)纖維參與某些疼痛的傳導(dǎo)，缺血壓迫阻滯有髓鞘纖維可以緩解人體激痛點(diǎn)的疼痛和牽涉痛。由此我們推測(cè)，有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點(diǎn)存在聯(lián)系。
　　本實(shí)驗(yàn)中，我們采用大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點(diǎn)作為研究對(duì)象，以更好的模擬人體激痛點(diǎn)。通過(guò)觸診結(jié)合肌電圖定位的方式來(lái)定位:即在肌肉觸診初步定位激痛點(diǎn)后，使用針刺肌電圖進(jìn)一步確定此處是否存在激痛點(diǎn)特異性的自發(fā)性電活動(dòng)，

6、以此增加定位的準(zhǔn)確性。同時(shí)，我們對(duì)此種方法取得的激痛點(diǎn)做了活檢，并與正常肌肉組織做了對(duì)比。為進(jìn)一步研究激痛點(diǎn)的神經(jīng)支配，特別是有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點(diǎn)的聯(lián)系，我們采用了改良的Cajal吡啶銀染色對(duì)激痛點(diǎn)處的神經(jīng)纖維末梢進(jìn)行了研究，而且通過(guò)有髓鞘神經(jīng)纖維特異性抗體(NF200)的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)激痛點(diǎn)的有髓鞘神經(jīng)纖維分布做出進(jìn)一步分析。
　　目的：
　　1.尋找定位大鼠股二頭肌中自然形成的激痛點(diǎn)，作為臨床激痛點(diǎn)的動(dòng)物模型。<

7、br>　　2.研究大鼠激痛點(diǎn)相應(yīng)形態(tài)學(xué)改變，并與正常肌肉組織進(jìn)行對(duì)比。
　　3.明確大鼠激痛點(diǎn)的神經(jīng)纖維、有髓鞘神經(jīng)纖維支配情況。
　　研究方法：
　　1.大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)的定位
　　取260～270g重的清潔級(jí)Wistar大鼠，淺麻醉后俯臥位固定，清除股后部毛發(fā)。首先以觸診方式確定大鼠股二頭肌內(nèi)較為堅(jiān)硬的肌緊張帶，沿該肌緊張帶擠壓，當(dāng)該側(cè)下肢出現(xiàn)局部緊張反應(yīng)時(shí)，可初步認(rèn)定此處為激痛點(diǎn)。繼

8、而以肌電圖測(cè)定，當(dāng)刺入初步確定的激痛點(diǎn)處的刺激電極記錄到自發(fā)性電活動(dòng)，而刺入臨近肌肉中的對(duì)照電極無(wú)自發(fā)性電活動(dòng)時(shí)，可進(jìn)一步確認(rèn)激痛點(diǎn)。非激痛點(diǎn)處無(wú)自發(fā)性電活動(dòng)且無(wú)局部緊張反應(yīng)。
　　2.大鼠股二頭肌激痛點(diǎn)及非激痛點(diǎn)的取材
　　確定激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)后，保持刺激電極不動(dòng)，逐層切開(kāi)皮膚及皮下組織，暴露股二頭肌。取下刺激電極針頭附近直徑3mm的肌肉。
　　3.大鼠股二頭肌激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)肌肉組織的活檢
　　所取激痛點(diǎn)/非

9、激痛點(diǎn)組織塊經(jīng)4％多聚甲醛固定過(guò)夜、組織脫水、石蠟包埋、組織切片，制成4μ m厚的切片。光鏡下觀察肌纖維分布及走行等形態(tài)學(xué)改變。
　　4.改良的Cajal吡啶銀染色示激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)處神經(jīng)纖維
　　按照改良的Cajal法，對(duì)取材的激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)組織塊依次進(jìn)行:固定、硝酸銀著色、焦性沒(méi)食子酸還原等操作后，經(jīng)過(guò)組織脫水、石蠟包埋，4μ m縱/橫切片、脫蠟水化、脫水透明、封片，進(jìn)行光鏡下觀察，計(jì)數(shù)被銀染為棕黑色的神經(jīng)末梢數(shù)目。<

10、br>　　5.NF200免疫組化檢測(cè)激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)有髓鞘神經(jīng)纖維
　　取激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)組織塊，經(jīng)4％多聚甲醛固定過(guò)夜、組織脫水、石蠟包埋，制成4μ m縱/橫切面切片。進(jìn)行NF200免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)組織中有髓神經(jīng)纖維末梢，光鏡下計(jì)數(shù)棕黃色的陽(yáng)性神經(jīng)末梢數(shù)量。
　　6.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)
　　銀染/NF200陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)目均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式記錄，對(duì)其差異分別進(jìn)行t檢驗(yàn)。若P＜0.05，認(rèn)為差異

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.使用觸診結(jié)合肌電圖檢測(cè)自發(fā)性電活動(dòng)的方法可以成功定位大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點(diǎn)。
　　2.激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)活檢:激痛點(diǎn)處肌纖維排列錯(cuò)亂、增粗腫脹，其中可見(jiàn)收縮帶及較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，非激痛點(diǎn)處肌纖維排列整齊，無(wú)明顯炎性浸潤(rùn)。
　　3.改良Cajal吡啶銀染色:肌肉縱切面:在激痛點(diǎn)和非激痛點(diǎn)的肌纖維間隙可見(jiàn)被銀染為棕黑色的神經(jīng)纖維沿肌纖維走向分布。肌肉橫切面:激痛點(diǎn)處銀染的神經(jīng)

12、纖維數(shù)量較多(15.97±1.67)，非激痛點(diǎn)處銀染纖維數(shù)量少(11.06±1.54)，二者差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　4.NF200染色顯示:肌肉縱切面:激痛點(diǎn)和非激痛點(diǎn)的肌纖維間隙均可見(jiàn)NF200陽(yáng)性的棕黃色的神經(jīng)纖維。肌肉橫切面:激痛點(diǎn)處NF200陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量較多(5.720±1.31)，非激痛點(diǎn)處NF200陽(yáng)性纖維數(shù)量較少(2.930±1.09)，二者差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：

13、　　1.肌肉觸診結(jié)合肌電圖定位的方式可以確定大鼠股二頭肌中自然形成的激痛點(diǎn)，作為人體激痛點(diǎn)的動(dòng)物模型。
　　2.激痛點(diǎn)中肌纖維排列錯(cuò)亂、略有腫脹，可見(jiàn)有緊張帶形成及較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　3.激痛點(diǎn)有更多的神經(jīng)纖維末梢存在，特別是有髓鞘神經(jīng)纖維末梢。
　　4.結(jié)合既往臨床試驗(yàn)結(jié)果，有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點(diǎn)的病理過(guò)程存在聯(lián)系。
　　第二部分有髓鞘神經(jīng)纖維對(duì)激痛點(diǎn)相應(yīng)脊髓中樞敏化及神經(jīng)元形態(tài)的影響機(jī)制研究
　

14、　研究背景：
　　中樞敏化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外周刺激的過(guò)度反應(yīng)，是神經(jīng)性疼痛的共有機(jī)制。脊髓具有可塑性，持續(xù)傳人的外周傷害性刺激可以激活脊髓背角的神經(jīng)元，使脊髓背角發(fā)生重構(gòu)，如神經(jīng)纖維的出芽、神經(jīng)元表型轉(zhuǎn)變等，導(dǎo)致神經(jīng)元表達(dá)受體種類增多、原有神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，或開(kāi)始表達(dá)新的神經(jīng)遞質(zhì)。上述改變可以造成外周傷害性刺激的感受閾增加，反應(yīng)強(qiáng)度提高，即中樞敏化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，谷氨酸受體的表達(dá)程度常作為判斷中樞敏化存在與否及衡量其敏化程度的指標(biāo)。

15、
　　既往研究顯示，有髓鞘神經(jīng)纖維參與了炎癥及外傷引起的中樞敏化過(guò)程;亦有文獻(xiàn)提出，激痛點(diǎn)對(duì)應(yīng)的脊髓層面可能存在中樞敏化。在本研究第一部分中，我們發(fā)現(xiàn)激痛點(diǎn)處的有髓鞘神經(jīng)纖維數(shù)目明顯高于正常肌肉組織。而且之前的臨床試驗(yàn)也證實(shí)了有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點(diǎn)的疼痛、自發(fā)性電位等特異性改變存在聯(lián)系。我們推測(cè)有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點(diǎn)的中樞敏化存在聯(lián)系。
　　此外，有學(xué)者采用辣根過(guò)氧化物(HRP)神經(jīng)示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠激痛點(diǎn)相應(yīng)脊髓背根神經(jīng)

16、節(jié)中的感覺(jué)神經(jīng)元有數(shù)量減少、平均體積減小的趨勢(shì)。但尚無(wú)關(guān)于激痛點(diǎn)相應(yīng)脊髓背角神經(jīng)元的報(bào)道。我們首次選用了霍亂毒素亞單位結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶(CB-HRP)，一種可特異性追蹤有髓鞘神經(jīng)纖維的神經(jīng)示蹤劑，來(lái)研究激痛點(diǎn)相關(guān)脊髓背角的中間神經(jīng)元及脊髓腹角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，同時(shí)判定其改變是否與有髓鞘神經(jīng)纖維有關(guān)聯(lián)。
　　既往臨床試驗(yàn)獲得的多為易受到主觀影響的間接證據(jù)（VAS痛覺(jué)指數(shù)等），中樞層面的形態(tài)學(xué)改變等客觀證據(jù)無(wú)法得到。為了進(jìn)一步深入研究

17、有髓鞘神經(jīng)纖維在激痛點(diǎn)病理過(guò)程中所發(fā)揮的作用，并獲得更直接的證據(jù)支持，我們采用大鼠為研究對(duì)象，觀察激痛點(diǎn)、河豚毒素特異性阻滯有髓鞘神經(jīng)纖維后的激痛點(diǎn)對(duì)應(yīng)的脊髓層面的中樞敏化情況及脊髓腹角、背角神經(jīng)元大小、數(shù)目的改變，并分別與正常組織對(duì)應(yīng)的脊髓層面進(jìn)行比較。
　　目的：
　　1.研究有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點(diǎn)中樞敏化之間的聯(lián)系。
　　2.研究有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點(diǎn)對(duì)應(yīng)脊髓神經(jīng)元大小、數(shù)目改變的聯(lián)系。
　　研究方法

18、>　　1.谷氨酸受體免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　1)動(dòng)物分組:24只確定存在股二頭肌自然形成的激痛點(diǎn)的Wistar雄性大鼠被隨機(jī)均分為激痛點(diǎn)組/生理鹽水組/河豚毒素組，另外8只確定不存在股二頭肌激痛點(diǎn)的Wistar雄性大鼠用作正常對(duì)照組。
　　2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及取材:生理鹽水組和河豚毒素組:分別在激痛點(diǎn)處注入0.1ml生理鹽水/0.1ml1μM的河豚毒素，每24小時(shí)一次，共6次。最后一次注射操作24小時(shí)后，大鼠經(jīng)深度麻醉、多聚甲

19、醛心臟灌注固定，取激痛點(diǎn)對(duì)應(yīng)脊髓(L5)層面;經(jīng)后固定、梯度沉糖、OCT包埋、切片，制成8μm厚的脊髓橫切面冰凍切片。正常組和激痛點(diǎn)組:不做特殊處理，同樣制得脊髓L5段的冰凍切片。
　　3)免疫組化實(shí)驗(yàn):分別進(jìn)行這4組脊髓切片的谷氨酸受體(mGluR1α/mGluR5/NMDAR1)相應(yīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其在脊髓背角的表達(dá)情況（陽(yáng)性神經(jīng)元位置、陽(yáng)性神經(jīng)元比率）。
　　4)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì):所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

20、對(duì)其進(jìn)行正態(tài)分布分析后，選用單因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗(yàn)分析各組陽(yáng)性神經(jīng)元率差異。若P＜0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.CB-HRP神經(jīng)示蹤技術(shù)研究激痛點(diǎn)/非激痛點(diǎn)對(duì)應(yīng)脊髓層面神經(jīng)元。
　　1)動(dòng)物分組:24只確定存在股二頭肌自然形成的激痛點(diǎn)的Wistar雄性大鼠被隨機(jī)均分為激痛點(diǎn)組/生理鹽水組/河豚毒素組，另外8只確定不存在股二頭肌激痛點(diǎn)的Wistar雄性

21、大鼠用作正常對(duì)照組。
　　2)動(dòng)物處理:生理鹽水組和河豚毒素組:分別在激痛點(diǎn)處注入0.1ml生理鹽水/0.1 ml1μM的河豚毒素，每24小時(shí)一次，共6次。最后一次注射24小時(shí)后，在激痛點(diǎn)處以微量注射器注入20μlCB-HRP。正常組和激痛點(diǎn)組:在股二頭肌非激痛點(diǎn)處/激痛點(diǎn)處以微量注射器注入20μlCB-HRP。
　　3)取材:注入CB-HRP48小時(shí)后，大鼠深度麻醉，分別以生理鹽水、固定劑（由多聚甲醛、蔗糖、磷酸緩沖液配制

22、而成）、蔗糖行心臟灌注固定，取脊髓L5段，經(jīng)梯度沉糖、OCT包埋、切片，制成10μm厚的脊髓橫切面冰凍切片。
　　4)觀察被標(biāo)記神經(jīng)元的位置分布;根據(jù)被標(biāo)記神經(jīng)元位置及與疼痛的聯(lián)系，對(duì)脊髓背角諸板層的中間神經(jīng)元及脊髓腹角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，分別進(jìn)行數(shù)量和平均直徑的分析。
　　5)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì):所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示。對(duì)其進(jìn)行正態(tài)分布分析后，選用單因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Compa

23、rison Test后檢驗(yàn)分析各組結(jié)果差異。若P＜0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.谷氨酸受體免疫組化實(shí)驗(yàn)。
　　1)在4組結(jié)果中，mGluR1α/mGluR5/NMDAR1在脊髓背角的表達(dá)位置基本相同:mGluR1α位于脊髓背角深層（第Ⅲ-Ⅳ板層）、mGluR5多表達(dá)于第Ⅰ-Ⅱ板層、NMDAR1陽(yáng)性神經(jīng)元可見(jiàn)于整個(gè)脊髓背角。
　　2)根據(jù)上述每個(gè)受體的表達(dá)部位分別進(jìn)行陽(yáng)性神經(jīng)元率檢測(cè)。針對(duì)

24、相同板層中特定受體:單因素方差分析結(jié)果顯示各組陽(yáng)性神經(jīng)元率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05):激痛點(diǎn)組、生理鹽水組的陽(yáng)性神經(jīng)元率最高，河豚毒素組陽(yáng)性神經(jīng)元率居中，正常組最低;Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗(yàn)結(jié)果提示:在4組中，激痛點(diǎn)組和生理鹽水組二者無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。
　　2.CB-HRP神經(jīng)元標(biāo)記。
　　1)在4組結(jié)果中

25、，可以在脊髓全層見(jiàn)到被CB-HRP標(biāo)記為亮藍(lán)綠色的神經(jīng)元，其位置基本相同:脊髓背角第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ板層及第Ⅴ板層的外側(cè)1/3部分及脊髓腹角第Ⅸ板層標(biāo)記神經(jīng)元最多。根據(jù)被標(biāo)記神經(jīng)元所在位置與傷害性刺激的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行具體定量分析。
　　2) CB-HRP神經(jīng)元直徑:對(duì)于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板層、第Ⅴ板層（外1/3部分）、脊髓腹角第Ⅸ板層中的某一特定板層:單因素方差分析提示各組平均直徑有顯著差異(P＜0.05):激痛點(diǎn)組、生理鹽水組的標(biāo)記神經(jīng)

26、元直徑最小，河豚毒素組居中，正常組最大;Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗(yàn)結(jié)果提示激痛點(diǎn)組和生理鹽水組二者無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。
　　3) CB-HRP神經(jīng)元數(shù)目:對(duì)于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板層、第Ⅴ板層外1/3部分中的相同部位，單因素方差分析結(jié)果顯示4組間有差異(P＜0.05):激痛點(diǎn)組、生理鹽水組的標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)目最少，河豚毒素組居中，

27、正常組最多，Newman-KeulsMultiple Comparison Test后檢驗(yàn)結(jié)果提示激痛點(diǎn)組和生理鹽水組二者無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。對(duì)于脊髓腹角第Ⅸ板層:單因素方差分析結(jié)果顯示4組間有差異:正常組的標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)目最多，激痛點(diǎn)組、生理鹽水組河豚毒素組數(shù)目較少(P＜0.05)，Newman-Keuls MultipleComparison Test后檢驗(yàn)結(jié)果提示:生理鹽水組、