細(xì)胞內(nèi)鈣在內(nèi)皮素-1促肺腺癌細(xì)胞SPC-A1生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)是目前死亡原因居首位的惡性腫瘤之一，起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)40％為晚期患者，預(yù)后差。晚期NSCLC的一線標(biāo)準(zhǔn)治療是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。Meta分析顯示與最佳支持治療相比，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療中位生存期延長(zhǎng)2個(gè)月，1年生存率提高10％。盡管鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在晚期NSCLC治療中取得一些進(jìn)展，但其療效似已達(dá)平臺(tái)，一線治療的有效率很少超過(guò)40％，1年生存率多在30％

2、～40％，且以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療毒副作用大。因此，尋找一種高效低毒的治療方法勢(shì)在必行。隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)認(rèn)識(shí)的加深，針對(duì)細(xì)胞受體、基因、調(diào)控分子等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為靶點(diǎn)的分子靶向治療(MolecularTargetedthreapy)是近年腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。NSCLC目前主要的分子靶點(diǎn)藥物主要針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，上述靶向藥物單藥治療晚期NSCLC取得一定的療效，但有效率低。不同靶向藥物的聯(lián)合使用及尋找

3、新的靶向藥物是目前腫瘤治療的新趨勢(shì)。內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是強(qiáng)大的血管收縮劑，ET-1通過(guò)內(nèi)皮素受體(Endothelinreceptors，ETRs)起作用，內(nèi)皮素受體有A(ETAR)和B(ETBR)兩種亞型，它們都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，ET-1通過(guò)ETRs產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。既往的研究表明，內(nèi)皮素系統(tǒng)與腫瘤關(guān)系密切。內(nèi)皮素系統(tǒng)通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤血管形成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及促腫瘤骨轉(zhuǎn)移等方面在腫瘤發(fā)生發(fā)

4、展過(guò)程中起重要作用。有研究證實(shí)，肺癌組織及細(xì)胞存在ET-1及ETRs，肺癌細(xì)胞株可自行合成、釋放ET-1及表達(dá)ETRs，肺癌患者血漿及支氣管灌洗液中ET-1水平高于正常人，說(shuō)明內(nèi)皮素系統(tǒng)與肺癌也關(guān)系密切。因此，內(nèi)皮素系統(tǒng)有望成為肺癌靶向治療的新靶點(diǎn)，研究?jī)?nèi)皮素系統(tǒng)與肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有重要意義。 ET-1是強(qiáng)大的細(xì)胞促有絲分裂素，既往研究顯示，ET-1在體外能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等正常細(xì)胞增殖，同時(shí)ET-

5、1也能夠促進(jìn)卵巢癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且其促細(xì)胞生長(zhǎng)作用與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(IntracellarfreeCa2+，[Ca2+]i)有關(guān)。ET-1激活ETRs后使電壓依賴性和受體操縱性鈣通道開(kāi)放，促使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放；激活的ETRs還可通過(guò)磷脂酶活化三磷酸肌醇(IP3)促使Ca2+從貯存庫(kù)釋放至肌漿，使[Ca2+]i增多。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，也作為細(xì)胞核內(nèi)的信號(hào)參與DNA復(fù)制、修復(fù)、

6、基因轉(zhuǎn)錄、核蛋白磷酸化等過(guò)程，參與許多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。[Ca2+]i在ETRs促血管平滑肌細(xì)胞增值及部分腫瘤細(xì)胞如頭頸癌和卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用。而在肺癌細(xì)胞上ET-1與肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系及其機(jī)制目前尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株，探討：1、ET-1在SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用；2、鈣信號(hào)在ET-1促SPC-A1細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及其機(jī)制。 第一部分內(nèi)皮素-1及其受體在肺腺癌細(xì)胞SPC-A1生長(zhǎng)

7、中的作用 采用MTT’(四甲基偶氮唑鹽)比色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，探討ET-1在肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較用Dunnett's檢驗(yàn)。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.ET-1(10-15mol/L～10-8

8、mol/L)具促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞增殖作用，在10-15mol/L～10-10mol/L濃度范圍，作用呈濃度依賴性，差異有顯著性(F=502.493，P=0.000<0.05)。在10-10mol/L～10-8mol/L時(shí)作用呈飽和狀態(tài)。 2.ET-1(10-10mol/L)促SPC-A1細(xì)胞增殖作用可被ETAR拮抗劑BQ123(10-7mol/L)阻斷(P=0.001<0.05)，不受ETBR拮抗劑BQ788(10-7mol/

9、L)影響(P=0.872>0.05)。說(shuō)明ET-1促SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)作用是通過(guò)作用于細(xì)胞膜ETAR。 第二部分內(nèi)皮素-1對(duì)人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響及機(jī)制 采用Fura-2/AM熒光技術(shù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)，檢測(cè)ET-1促肺腺癌SPC-A1細(xì)胞[Ca2+]i濃度升高的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采

10、用t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較用Dunnett，s檢驗(yàn)。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.ET-1在體外能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞SPC-A1細(xì)胞[Ca2+]i濃度升高，ET-1(10-15mol/L～10-8mol/L)呈濃度依賴性，差異有顯著性(F=7284.365，P=0.000<0.05)。其作用能夠被ETAR特異性拮抗劑BQ123

11、完全阻滯(P=0.001<0.05)，ET-1通過(guò)ETAR促SPC-A1細(xì)胞[Ca2+]i升高。ET-1促SPC-A1細(xì)胞[Ca2+]i濃度升高由起始的快速上升期和接下來(lái)的平臺(tái)期兩個(gè)時(shí)相組成，由基礎(chǔ)值的57.54±11.9nmol/L，上升到最高89.5+19.5nmol/L。 2.細(xì)胞外無(wú)Ca2+溶液，[Ca2+]i基礎(chǔ)值顯著降低，同時(shí)ET-1促[Ca2+]i的升高的作用可顯著減弱(F=16.653，P=0.002<0.05)

12、。細(xì)胞外正常Ca2+溶度時(shí)，ET-1作用前加入電壓依賴型鈣通道阻滯劑Nifedipine(10-6mol/L)或非特異性離子通道拮抗劑SKF96365(10-7mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i升高作用都明顯減弱，有顯著性差異(P=0.001<0.05)。SKF96365與Nifedipine減弱ET-1促[Ca2+]i升高作用的影響無(wú)顯著差別(P=0.720>0.05)。 3、Ryanodine受體激動(dòng)劑Ryanodin

13、e(50×10-6mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i的作用減弱(t=11.353，P=0.004<0.05)。加入磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122(10-5mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i的作用減弱(P=0.015<0.05)，而U73122無(wú)活性類似物U73433(10-5mol/L)不影響ET-1促[Ca2+]i的作用(P=0.921>0.05)。蛋白激酶C(PKC)抑制劑Staurosporine(2×10-9m

14、ol/L)對(duì)ET-1促[Ca2+]i的作用無(wú)顯著變化(t=0.712，P=0.486>0.05)。 第三部分細(xì)胞內(nèi)鈣在內(nèi)皮素-1促肺腺癌細(xì)胞SPC-A1生長(zhǎng)中的作用 本實(shí)驗(yàn)部分在上述一、二的基礎(chǔ)上采用MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞外無(wú)Ca2+時(shí)及使用特異性L-型Ca2+通道阻滯劑及PLC特異性拮抗劑等，觀察ET-1促肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用是否受影響，探討細(xì)胞內(nèi)鈣在ET-1促肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

15、差(x±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較用Dunnett’s檢驗(yàn)。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1、細(xì)胞外無(wú)Ca2+并用EGTA進(jìn)一步清除細(xì)胞外二價(jià)離子形成細(xì)胞外無(wú)Ca2+溶液，ET-1促SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用顯著受抑制(P=0.001<0.05)。L-型Ca2+通

16、道阻滯劑Nifedipine(10-6mol/L)能夠阻斷ET-1促SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)作用(P=0.001<0.05)。 2、磷脂酶C特異性(PLC)拮抗劑U73122也能夠部分抑制ET-1促SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(P=0.001<0.05)；U73122類似物U73433對(duì)ET-1的上述作用無(wú)影響(P=0.986>0.05)。 結(jié)論：在體外，ET-1通過(guò)激活人肺腺癌SPC.A1細(xì)胞ETAR受體促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及[Ca