5-FU可富集肺腺癌SPC-A1細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞.pdf

1、目的:
　　 肺癌是對(duì)人類健康危害極大的惡性腫瘤，我國(guó)是肺癌發(fā)病率較高的地區(qū)，盡管目前我國(guó)肺癌的發(fā)病率有下降趨勢(shì)，但其發(fā)病率和死亡率仍高居惡性腫瘤首位。由于肺癌的發(fā)病機(jī)制不清，尚不能有效地預(yù)防其發(fā)生，因此探索肺癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，尋找特異性的阻斷和治療方法一直是人們努力的方向。
　　 最近，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)存在少量維持惡性生長(zhǎng)的并具備自我更新能力的細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞具備較高惡性程度的細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem

2、 cell，CSC)或腫瘤起始細(xì)胞.目前已經(jīng)在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤中證實(shí)了CSC的存在．因此，根據(jù)此學(xué)說推測(cè)肺癌也可能來源于干細(xì)胞，是一種干細(xì)胞疾病。傳統(tǒng)治療方法雖然可使腫瘤體積明顯縮小，有的甚至可達(dá)到完全緩解，但實(shí)際上大部分腫瘤經(jīng)過一段時(shí)間的緩解期之后又會(huì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這可能是由于現(xiàn)有的治療手段沒有清除這些決定復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵細(xì)胞——腫瘤干細(xì)胞的緣故。
　　 側(cè)群細(xì)胞(Side population cel

3、ls，SP)是Goodell在對(duì)造血干/祖細(xì)胞分離時(shí)發(fā)現(xiàn)的一群特殊干細(xì)胞.由于其細(xì)胞膜表面高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette membrane tranon-sporter，ABC)，可將DNA染料Hoechst33342外排至細(xì)胞外，并且具備自我更新、多向分化、成瘤性等一系列干細(xì)胞的生物學(xué)特征。
　　 肺癌細(xì)胞對(duì)一些化療藥物具有耐藥性，且大部分耐藥細(xì)胞被5-FU阻滯于G0期，而研究表明，腫瘤干細(xì)胞大

4、多處于G0期。因此我們猜想，對(duì)5-FU表現(xiàn)出耐藥性的細(xì)胞群中是否可能包含了大量的腫瘤干細(xì)胞。我們能否利用這一耐藥模型來富集肺癌干細(xì)胞?本研究旨在探索5-FU對(duì)于肺腺癌細(xì)胞系SPC-A1中腫瘤干細(xì)胞的影響。
　　 方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 肺腺癌SPC-A1細(xì)胞系購自ATCC。SPC-A1細(xì)胞在含有10％胎牛血清(GBICOInC.，NY，USA)的RPMI1640培養(yǎng)基(GBICOInc.，NY，USA)

5、和含有10％牛血清(GBICO Inc.，NY，USA)中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。
　　 2、四甲基偶氮哩鹽(tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別接種于4個(gè)96孔板培養(yǎng)板。接種24小時(shí)后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時(shí)分別加入MTT(5mg/m1)20μl，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，每孔加入150μlDMSO溶解結(jié)晶，測(cè)定各孔吸光度。

6、>　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制成500μL的細(xì)胞懸液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機(jī)檢測(cè)，ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
　　 4、免疫熒光染色
　　 接種細(xì)胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2％的Triton-X100于常溫打孔15-30分鐘。1％的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后加入一抗

7、，4℃過夜。次日，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1個(gè)小時(shí)后，DAPI染核，熒光顯微鏡觀察。
　　 5、Westernblot
　　 收集細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后用3％小牛血清封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2小時(shí)后ECL發(fā)光，曝光膠片后，測(cè)定灰度值
　　 6、FACS分選側(cè)群細(xì)胞
　　 37℃預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液（含2％FBS和10mmol/1 HEPES緩沖液）重懸

8、，計(jì)數(shù)，至細(xì)胞密度為1×106/ml;實(shí)驗(yàn)分兩組：一組先加入Verapamil(50μg/m1)37℃，15min，再加入Hoechst33342熒光染料(5μg/m1)37℃反應(yīng)90min;另一組直接加入Hoechst33342熒光染料(5μg/m1)37℃反應(yīng)90min，洗滌并重懸，PI(2μg/ml)染死亡細(xì)胞；紫外光源流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)及分選。
　　 7、Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲試驗(yàn)
　　 用無血清的培養(yǎng)

9、基將Matrigel加入到孔徑為8.0μm的Tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細(xì)胞懸液(5×105cells/ml)，下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導(dǎo)劑，孵箱中孵育36小時(shí)后取出，用無菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經(jīng)固定、染色后封片，鏡檢10個(gè)高倍視野(400×)。
　　 8、克隆形成能力實(shí)驗(yàn)
　　 將剛剛分選所得的SP和non-SP細(xì)胞分別接種于六孔扳，培養(yǎng)一周左右進(jìn)行結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)形成的克

10、隆數(shù)（見圖）?？寺⌒纬陕?CloneFormation Efficiency，CFE)的計(jì)算公式為：CFE=克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100％。
　　 9、裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)
　　 從SPC-A1細(xì)胞系中分選出的SP和non-SP細(xì)胞分別用RPMI.1640完全培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/ml，每個(gè)濃度接種3只BALB/c免疫缺陷小鼠，注射后每隔兩天觀察一次長(zhǎng)瘤情況，注射后28天，斷頸處死。
　　 10、

11、統(tǒng)計(jì)分析
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。所有以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示的數(shù)據(jù)，其實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，P值＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT結(jié)果提示：5-FU可抑制肺腺癌細(xì)胞SPC-A1增殖，不同濃度的5-FU作用于肺癌SPC-A1細(xì)胞后，細(xì)胞的生長(zhǎng)有不同程度的抑制，這種抑制呈時(shí)間劑量依賴性，5-FU對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)約為100μg/ml。

12、r>　　 2、細(xì)胞周期結(jié)果提示：IC50的5-FU作用于肺腺癌細(xì)胞系后，S期細(xì)胞比例從33.14％減少至18.20％，G0/G1期細(xì)胞比例從58.46％增加至76.68％。
　　 3、Westem-blot及免疫熒光結(jié)果提示：5-FU可增強(qiáng)SPC-A1細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，在正常的肺腺癌SPC-A1細(xì)胞中Oct3/4，Sox2和ABCG2幾乎不表達(dá)，在5-FU半數(shù)抑制率(IC50)約為100μg/ml作用24h，48h后，S

13、PC-A1中Oct3/4，Sox2和ABCG2表達(dá)逐漸增強(qiáng)，三者表達(dá)趨勢(shì)接近一致。
　　 4、FACS結(jié)果提示：貼壁生長(zhǎng)的SPC-A1細(xì)胞其SP細(xì)胞比例約為1.32％，5-FU分別作用24h，48h后，SP細(xì)胞比例顯著升高，分別達(dá)4.8％，8.0％。
　　 5、Transwell結(jié)果提示：SP細(xì)胞穿過基底膜的平均細(xì)胞數(shù)(60.75)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于轉(zhuǎn)染non-SP細(xì)胞(20.13)，這提示SP細(xì)胞具備較強(qiáng)侵襲能力，具備腫瘤干細(xì)胞

14、特性。SP細(xì)胞相對(duì)non-SP細(xì)胞具備較強(qiáng)侵襲能力。
　　 6、克隆形成能力計(jì)算所得SP細(xì)胞的CFE為40±2.3％，而non-SP細(xì)胞的CFE僅為14±1.2％，二者差異顯著(P＜0.05）。
　　 7、裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)提示：SP細(xì)胞及non-SP細(xì)胞的致瘤能力存在顯著差異。相同數(shù)量的SP細(xì)胞在同一觀察時(shí)間點(diǎn)可以形成更大的腫瘤，且形成腫瘤的潛伏期較短。移植瘤組織經(jīng)石蠟包埋切片，HE染色檢查證實(shí)為腺癌。
　　 結(jié)論: