Ad-ING4-polyA-promoter-OSM對SPC-A1肺腺癌細胞的體外抑癌增效作用及其分子機制.pdf

1、目的：研究ING4(腫瘤生長抑制因子4)和OSM（抑瘤素M）雙基因共表達腺病毒載體對SPC-A1肺腺癌細胞的體外抑癌增效作用及其分子機制。
　　方法：構(gòu)建ING4和OSM雙基因共表達的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad-ING4-polyA-promoter-OSM(簡稱Ad-ING4-OSM)。感染QBI-293A細胞，進行病毒擴增和效價測定。用RT-PCR法鑒定目的基因的轉(zhuǎn)錄。用50MOI的Ad-ING4-OSM作用于體外培養(yǎng)的人肺

2、腺癌細胞SPC-A1，RT-PCR法、Westernblotting法鑒定目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達。MTT法檢測PBS組、AdV組、Ad-ING4組、Ad-OSM組、Ad-ING4-OSM組對SPC-A1細胞作用1～4天的生長抑制作用，繪制細胞生長曲線，并通過流式細胞術(shù)(FCM)檢測上述各組對SPC-A1細胞凋亡率的影響。通過對比分析研究Ad-ING4-OSM的抑癌增效作用。用RT-PCR檢測P27，P53及Survivin等凋亡相關(guān)基因的

3、轉(zhuǎn)錄，并用Westernblotting檢測CleavedCaspase-3的表達，探討Ad-ING4-OSM誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的分子機制。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了雙啟動子（polyA+promoter）介導(dǎo)的ING4和OSM雙基因共表達腺病毒載體（Ad-ING4-polyA+promoter-OSM）。Ad-ING4-OSM可在QBI-293A細胞中復(fù)制增殖，48h后在倒置顯微鏡下可見細胞變圓，呈葡萄狀聚集，倒置熒光顯微鏡下可見綠色

4、熒光，呈現(xiàn)高感染效率。RT-PCR檢測可見ING4和OSM基因成功轉(zhuǎn)錄。病毒效價檢測可高達109pfu/ml。Ad-ING4-OSM作用于SPC-A1細胞后，RT-PCR、Westernblotting結(jié)果顯示目的基因在SPC-A1細胞中成功轉(zhuǎn)錄及表達，并能顯著抑制SPC-A1細胞的生長且呈現(xiàn)時間依賴性。RT-PCR結(jié)果顯示該雙基因可明顯上調(diào)SPC-A1肺腺癌細胞中的P27，P53基因轉(zhuǎn)錄和下調(diào)Survivin基因的轉(zhuǎn)錄。Ad-ING4

5、-OSM對SPC-A1細胞生長抑制及誘導(dǎo)細胞凋亡作用明顯優(yōu)于Ad-ING4、Ad-OSM單基因組（P＜0.05)，顯示雙基因具有抑癌增效的協(xié)同作用（Q=1.18）。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了ING4和OSM雙基因共表達腺病毒載體Ad-ING4-OSM。
　　2、Ad-ING4-OSM雙基因共表達能在體外抑制肺癌SPC-A1細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡，且呈現(xiàn)明顯的抑癌增效協(xié)同作用。
　　3、Ad-ING4-OSM