骨髓間充質干細胞對實驗性自身免疫性肝炎PD-L1通路的影響.pdf

1、目的:
　　自身免疫性肝炎(AIH)是以肝臟免疫失調為特點，女性患者為主，伴有升高的轉氨酶及免疫球蛋白G水平，自身抗體陽性的界面性肝炎。AIH的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，在環(huán)境、藥物、感染等外在因素的誘發(fā)，產生肝臟免疫耐受失調。其病理表現為門靜脈周或匯管區(qū)免疫細胞侵潤形成的界面性肝炎，包括大量的淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞。傳統(tǒng)的臨床治療是單用糖皮質激素或聯(lián)合免疫抑制劑硫唑嘌呤。但是，不是所有的患者對傳統(tǒng)療都有效，并且存在強烈的副

2、作用及停藥后復發(fā)。因此尋求新的免疫抑制藥物或新的治療方案是亟待解決的問題。配體程序性死亡-1配體(PD-L1)是一種免疫反應的抑制性共刺激分子程序性死亡-1(PD-1)的配體。表達在B細胞、單核細胞、DCs和MSCs等。PD-L1作為負向免疫調節(jié)因子參與多種自身免疫性疾病的免疫反應。PD-L1在骨髓間充質干細胞(MSCs)調節(jié)免疫反應的作用機制尚不明確，因此本實驗通過MSCs干預實驗性自身免疫性肝炎(EAH)小鼠模型，觀察其對程序性死亡

3、配體1(PD-L1)及IL-17、IL-23的表達影響，并探討可能的作用機制。
　　方法:
　　1.實驗性自身免疫性肝炎(EAH)模型的制備:取3只C57BL/6雄性4-6周小鼠，麻醉處死后，以預冷的無菌PBS經門靜脈灌注，取肝臟剪碎勻漿，于-80℃反復凍融3次，150g，離心10min后，取上清。超速離心100，000 g，離心1h，最終得到的上清液為總s-100肝抗原。去除對T細胞有毒性成分，采用瓊脂糖凝膠Sepharo

4、se CL-6B柱分離s-100第一峰產物。新鮮制備的s-100第一峰產物蛋白濃度在0.5-2g/L與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)混合乳化。于實驗開始第1天和第7天，腹腔注射每只小鼠1ml。2周后既可建立EAH模型。
　　2.MSCs的培養(yǎng)復蘇凍存的C57BL/6小鼠MSCs，使用專門的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時換液，待細胞生長至80％-90％融合時按1∶3傳代。細胞培養(yǎng)至足夠數量，制成細胞懸液備

5、用。
　　3.動物實驗:44只健康C57BL/6雄性4-6周小鼠隨機選取6只，作為空白對照，與造模及藥物注射同時，注射等劑量的生理鹽水。余下建立EAH模型，首次注射后第20天，隨機取6只小鼠留取血清和肝臟標本鑒定造模是否成功，將成功造模的18只小鼠隨機分組成三組，模型組:用生理鹽水于第21、28、35天，采用尾靜脈注射，每只小鼠注射0.1ml。藥物治療組:潑尼松、硫唑嘌呤分別溶于生理鹽水，每只各5mg于第21、28、35天腹腔注射

6、。干細胞治療組:C57骨髓MSCs使用無菌生理鹽水重懸細胞，使干細胞終濃度為1×106/ml，實驗第21天每只小鼠尾靜脈注射0.1ml上述細胞懸液，即每只小鼠治療的細胞數為1×105/ml。所有實驗動物于實驗第42天處死采集血和肝臟標本。肝組織切成邊長0.5cm的立方體，放入1％中性甲醛溶液固定24小時，石蠟包埋，制備組織切片HE染色后，光學顯微鏡下觀察肝組織的炎癥變化;全自動生化儀檢測各組小鼠生化指標丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨

7、酸氨基轉移酶(AST)的變化;反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測PD-L1、IL-17、IL-23mRNA表達情況;Western-Blot檢測各組小鼠肝組織PD-L1蛋白的表達情況。ELISA檢測IL-17、IL-23蛋白的表達情況。計量資料用均數±標準差（(x)±s）表示。統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0對各組數據進行比較分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.成功建立小鼠EAH模型:造模2周后

8、經過病理檢查后，小鼠肝臟實質和匯管區(qū)內浸潤大量炎癥細胞，其中以淋巴細胞為主，肝組織病變部位可見點、灶狀壞死或大片肝細胞壞死，局限于匯管區(qū)，特征性界面性炎表現，血清學檢測示ALT水平為110.00±13.239U/L，AST水平為447.61±28.671U/L。實驗性自身免疫性肝炎小鼠模型造模成功。
　　2.MSCs對EAH模型治療效果觀察:模型組小鼠平均血清ALT水平為97.33±14.390 U/L，AST水平為474.83±

9、31.670 U/L較對照組血清ALT水平為62.33±13.589 U/L，AST水平為176.17±19.104 U/L明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。金標準治療藥物組及干細胞治療組血清ALT、AST較模型組均有明顯下降(P＜0.01)。但是對照組與藥物組、MSCs組兩兩比較，均無統(tǒng)計學意義。組織學觀察，藥物治療后匯管區(qū)炎癥消退，無壞死灶，血管內皮完整，與正常對照組相似。MSCs治療后，匯管區(qū)可見少量炎癥細胞，壞死減輕，炎

10、癥細胞侵潤較模型組減少。Masson染色中，僅模型組匯管區(qū)可見少量藍色膠原染色，其余三組纖維化不明顯。按照參照肝臟Ishak評分系統(tǒng)對各小鼠的肝臟進行評分，對照組、模型組、藥物組、MSCs組評分分別為0.33±0.516、6.33±2.215、0.50±0.548、3.50±1.517。對照組與模型組、MSCs組比較有統(tǒng)計學有意義(P＜0.01)，模型組與藥物組、MSCs治療組比較有統(tǒng)計學有意義(P＜0.01)。觀察各組肝組織中PD-L

11、1、IL-17、IL-23mRNA的表達含量，模型組較對照組PD-L1表達量升高，藥物及MSCs治療后明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，但是MSCs治療組表達量較藥物組稍高。IL-17的趨勢與PD-L1相似。但是肝臟中IL-23表達量與前兩者相反，模型組與對照組相比降低，在藥物治療和干細胞移植后，表達量有所增加。Western blotting檢測肝組織中PD-L1蛋白表達量，對照組、模型組、藥物組、MSCs組分別為1.665±0.191、2

12、.591±0.516、1.674±0.256、2.091±0.291。對照組與模型組、MSCs組比較有統(tǒng)計學有意義(P＜0.05)，模型組與藥物組、MSCs治療組比較有統(tǒng)計學有意義(P＜0.01)。其變化趨勢與mRNA表達量一致。ELISA檢測肝組織中IL-17、IL-23蛋白表達量，IL-17的蛋白含量，在模型組明顯升高，大約增加一倍，在治療后均有下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。其蛋白表達量與轉錄水平一致。IL-23的變化趨勢