骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎PD-L1通路的影響.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  自身免疫性肝炎(AIH)是以肝臟免疫失調(diào)為特點(diǎn),女性患者為主,伴有升高的轉(zhuǎn)氨酶及免疫球蛋白G水平,自身抗體陽(yáng)性的界面性肝炎。AIH的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,在環(huán)境、藥物、感染等外在因素的誘發(fā),產(chǎn)生肝臟免疫耐受失調(diào)。其病理表現(xiàn)為門靜脈周或匯管區(qū)免疫細(xì)胞侵潤(rùn)形成的界面性肝炎,包括大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞。傳統(tǒng)的臨床治療是單用糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合免疫抑制劑硫唑嘌呤。但是,不是所有的患者對(duì)傳統(tǒng)療都有效,并且存在強(qiáng)烈的副

2、作用及停藥后復(fù)發(fā)。因此尋求新的免疫抑制藥物或新的治療方案是亟待解決的問(wèn)題。配體程序性死亡-1配體(PD-L1)是一種免疫反應(yīng)的抑制性共刺激分子程序性死亡-1(PD-1)的配體。表達(dá)在B細(xì)胞、單核細(xì)胞、DCs和MSCs等。PD-L1作為負(fù)向免疫調(diào)節(jié)因子參與多種自身免疫性疾病的免疫反應(yīng)。PD-L1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用機(jī)制尚不明確,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MSCs干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎(EAH)小鼠模型,觀察其對(duì)程序性死亡

3、配體1(PD-L1)及IL-17、IL-23的表達(dá)影響,并探討可能的作用機(jī)制。
  方法:
  1.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎(EAH)模型的制備:取3只C57BL/6雄性4-6周小鼠,麻醉處死后,以預(yù)冷的無(wú)菌PBS經(jīng)門靜脈灌注,取肝臟剪碎勻漿,于-80℃反復(fù)凍融3次,150g,離心10min后,取上清。超速離心100,000 g,離心1h,最終得到的上清液為總s-100肝抗原。去除對(duì)T細(xì)胞有毒性成分,采用瓊脂糖凝膠Sepharo

4、se CL-6B柱分離s-100第一峰產(chǎn)物。新鮮制備的s-100第一峰產(chǎn)物蛋白濃度在0.5-2g/L與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)混合乳化。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1天和第7天,腹腔注射每只小鼠1ml。2周后既可建立EAH模型。
  2.MSCs的培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的C57BL/6小鼠MSCs,使用專門的完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24小時(shí)換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)按1∶3傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至足夠數(shù)量,制成細(xì)胞懸液備

5、用。
  3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):44只健康C57BL/6雄性4-6周小鼠隨機(jī)選取6只,作為空白對(duì)照,與造模及藥物注射同時(shí),注射等劑量的生理鹽水。余下建立EAH模型,首次注射后第20天,隨機(jī)取6只小鼠留取血清和肝臟標(biāo)本鑒定造模是否成功,將成功造模的18只小鼠隨機(jī)分組成三組,模型組:用生理鹽水于第21、28、35天,采用尾靜脈注射,每只小鼠注射0.1ml。藥物治療組:潑尼松、硫唑嘌呤分別溶于生理鹽水,每只各5mg于第21、28、35天腹腔注射

6、。干細(xì)胞治療組:C57骨髓MSCs使用無(wú)菌生理鹽水重懸細(xì)胞,使干細(xì)胞終濃度為1×106/ml,實(shí)驗(yàn)第21天每只小鼠尾靜脈注射0.1ml上述細(xì)胞懸液,即每只小鼠治療的細(xì)胞數(shù)為1×105/ml。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第42天處死采集血和肝臟標(biāo)本。肝組織切成邊長(zhǎng)0.5cm的立方體,放入1%中性甲醛溶液固定24小時(shí),石蠟包埋,制備組織切片HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的炎癥變化;全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨

7、酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的變化;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PD-L1、IL-17、IL-23mRNA表達(dá)情況;Western-Blot檢測(cè)各組小鼠肝組織PD-L1蛋白的表達(dá)情況。ELISA檢測(cè)IL-17、IL-23蛋白的表達(dá)情況。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,P<0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)果:
  1.成功建立小鼠EAH模型:造模2周后

8、經(jīng)過(guò)病理檢查后,小鼠肝臟實(shí)質(zhì)和匯管區(qū)內(nèi)浸潤(rùn)大量炎癥細(xì)胞,其中以淋巴細(xì)胞為主,肝組織病變部位可見(jiàn)點(diǎn)、灶狀壞死或大片肝細(xì)胞壞死,局限于匯管區(qū),特征性界面性炎表現(xiàn),血清學(xué)檢測(cè)示ALT水平為110.00±13.239U/L,AST水平為447.61±28.671U/L。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎小鼠模型造模成功。
  2.MSCs對(duì)EAH模型治療效果觀察:模型組小鼠平均血清ALT水平為97.33±14.390 U/L,AST水平為474.83±

9、31.670 U/L較對(duì)照組血清ALT水平為62.33±13.589 U/L,AST水平為176.17±19.104 U/L明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。金標(biāo)準(zhǔn)治療藥物組及干細(xì)胞治療組血清ALT、AST較模型組均有明顯下降(P<0.01)。但是對(duì)照組與藥物組、MSCs組兩兩比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)觀察,藥物治療后匯管區(qū)炎癥消退,無(wú)壞死灶,血管內(nèi)皮完整,與正常對(duì)照組相似。MSCs治療后,匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞,壞死減輕,炎

10、癥細(xì)胞侵潤(rùn)較模型組減少。Masson染色中,僅模型組匯管區(qū)可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原染色,其余三組纖維化不明顯。按照參照肝臟Ishak評(píng)分系統(tǒng)對(duì)各小鼠的肝臟進(jìn)行評(píng)分,對(duì)照組、模型組、藥物組、MSCs組評(píng)分分別為0.33±0.516、6.33±2.215、0.50±0.548、3.50±1.517。對(duì)照組與模型組、MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.01),模型組與藥物組、MSCs治療組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.01)。觀察各組肝組織中PD-L

11、1、IL-17、IL-23mRNA的表達(dá)含量,模型組較對(duì)照組PD-L1表達(dá)量升高,藥物及MSCs治療后明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是MSCs治療組表達(dá)量較藥物組稍高。IL-17的趨勢(shì)與PD-L1相似。但是肝臟中IL-23表達(dá)量與前兩者相反,模型組與對(duì)照組相比降低,在藥物治療和干細(xì)胞移植后,表達(dá)量有所增加。Western blotting檢測(cè)肝組織中PD-L1蛋白表達(dá)量,對(duì)照組、模型組、藥物組、MSCs組分別為1.665±0.191、2

12、.591±0.516、1.674±0.256、2.091±0.291。對(duì)照組與模型組、MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05),模型組與藥物組、MSCs治療組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.01)。其變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)量一致。ELISA檢測(cè)肝組織中IL-17、IL-23蛋白表達(dá)量,IL-17的蛋白含量,在模型組明顯升高,大約增加一倍,在治療后均有下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其蛋白表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄水平一致。IL-23的變化趨勢(shì)

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