EB病毒相關(guān)永生化的人B淋巴細(xì)胞系的建立和stathmin 1基因的功能研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)在人群中普遍易感，與人類(lèi)傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等多種疾病相關(guān)。在體內(nèi)，EB病毒只能感染人上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞；在體外，EB病毒能轉(zhuǎn)化靜止期B淋巴細(xì)胞使其永生化(immortalization)。目前關(guān)于EB病毒致病機(jī)制的研究結(jié)果相當(dāng)一部分來(lái)自與病毒相關(guān)的人永生化B淋巴細(xì)胞。 靜止期B細(xì)胞

2、是終末分化細(xì)胞，在沒(méi)有抗原刺激時(shí)不能進(jìn)行有絲分裂。永生化B淋巴細(xì)胞也叫淋巴母細(xì)胞(lymphoblastoidcelllines，LCLs)，能持續(xù)不斷的分裂增殖傳代，可以有效保留B細(xì)胞的遺傳信息，因此可以作為一種細(xì)胞模型用于多種寶貴疾病資料的保存以及回顧性研究。 LCL的永生化機(jī)制雖經(jīng)多年研究，仍未解釋清楚。已有研究資料揭示該永生化過(guò)程非常復(fù)雜，與EB病毒的潛伏膜蛋白(latentmembraneprotein，LMP)、病毒

3、核抗原(nuclearantigen，NA)以及淋巴細(xì)胞癌基因、抑癌基因等多種分子有關(guān)。研究表明在LCL形成早期有一過(guò)性的stathmin蛋白表達(dá)水平增高，推測(cè)stathmin在B細(xì)胞永生化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 Stathmin1是普遍表達(dá)于真核細(xì)胞的一種微管調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)水平在不同組織細(xì)胞中有較大差異。在更新較快、生長(zhǎng)旺盛的組織，如骨髓和睪丸中表達(dá)水平較高，而在成人腦、脊髓等組織中的表達(dá)水平較低；另外，在部分腫瘤細(xì)胞如白血病

4、細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也有較高水平的stathmin1表達(dá)。 已證實(shí)Stathmin1可以直接和微管亞單位α/β二聚體相互作用形成stathmin1-α/β蛋白三聚體抑制微管蛋白的聚合；此外，stathmin1還可以促進(jìn)微管塌陷。部分研究結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)stathmin1的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)于細(xì)胞維持生長(zhǎng)狀態(tài)具有非常重要的意義，人為增加或者降低stathmin1表達(dá)水平可以明顯阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖分裂

5、。同樣，stathmin1正常空間結(jié)構(gòu)所依賴的氨基酸序列對(duì)于其發(fā)揮微管調(diào)節(jié)功能意義重大。149個(gè)氨基酸構(gòu)成的單肽鏈結(jié)構(gòu)，N末端、C末端靠近肽鏈中間部分都能對(duì)stathmin1-α/β蛋白三聚體的穩(wěn)定起到促進(jìn)作用，但是只有C末端通過(guò)增加GTP酶活性水解GTP降低微管穩(wěn)定性，促進(jìn)微管解聚。C末端7個(gè)氨基酸的缺失可以明顯減弱stathmin1的微管解聚作用。 Stathmin1分子上有四個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化水平?jīng)Q定了stathmin1

6、的功能狀態(tài)，當(dāng)四個(gè)位點(diǎn)全部都被磷酸化以后stathmin1失活。在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，stathmin1通過(guò)不斷調(diào)節(jié)磷酸化/去磷酸化過(guò)程而影響微管的組裝與解聚，從而影響紡錘體的形成與降解。在有絲分裂間期，stathmin1處于非磷酸化狀態(tài)，參與微管組裝/去組裝的調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞正常狀態(tài)；有絲分裂早期，stathmin1被磷酸化，微管蛋白組裝成微管，進(jìn)而形成有絲分裂必須的紡錘體；有絲分裂后期，stathmin1去磷酸化，微管解聚，紡錘體消失

7、，細(xì)胞退出有絲分裂。在細(xì)胞周期中stathmin1的磷酸化/去磷酸化水平需要多次改變以維持細(xì)胞的正常分裂。因此，stathmin1和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖密切相關(guān)，已經(jīng)成為一個(gè)抗腫瘤的研究熱點(diǎn)。有報(bào)道稱stathmin1參與了EB病毒相關(guān)的B淋巴細(xì)胞的永生化過(guò)程。 世界上80％的鼻咽癌患者出現(xiàn)在我國(guó)廣東省。95％的鼻咽癌患者臨床組織分型為低分化鱗癌或者未分化癌，常規(guī)治療方法首選放療，必要時(shí)結(jié)合化療，療效較好，但副作用較明顯。運(yùn)用分子生物學(xué)

8、方法針對(duì)鼻咽癌細(xì)胞低分化株凋亡的研究可能會(huì)為鼻咽癌生物治療提供一定理論依據(jù)。 本課題用活病毒感染人靜止期B淋巴細(xì)胞，建立了永生化B淋巴細(xì)胞系并對(duì)其生物學(xué)性狀做了初步鑒定；著眼于stathmin1，利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆其基因全序列到穿梭質(zhì)粒中構(gòu)建stathmin1野生型克隆載體，設(shè)計(jì)并構(gòu)建其突變體，同時(shí)利用兩步PCR法構(gòu)建三個(gè)針對(duì)stathmin1的干擾載體。在以正常人黑色素細(xì)胞為代表的正常細(xì)胞株以及鼻咽癌低分化鱗癌CNE-2細(xì)

9、胞株為代表的惡性腫瘤細(xì)胞中研究stathmin1對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的意義，探討stathmin1與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 主要研究方法和結(jié)果如下： 1、培養(yǎng)B95-8細(xì)胞，收集懸液，過(guò)濾獲得EBV活病毒，感染人外周血淋巴細(xì)胞使B細(xì)胞永生化獲得成功。細(xì)胞可以不斷傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，未出現(xiàn)凋亡峰。對(duì)永生化細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀分析LCL細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，結(jié)果為CD19陽(yáng)性，確定其細(xì)胞來(lái)源為B淋巴細(xì)胞。RT-PC

10、R方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EBV潛伏膜蛋白1基因表達(dá)陽(yáng)性證明永生化與EB病毒相關(guān)。對(duì)永生化細(xì)胞進(jìn)行核型分析表明永生化早期的細(xì)胞核型正常，沒(méi)有染色體的結(jié)構(gòu)畸變。 2、兩步PCR法擴(kuò)增得到三段針對(duì)stathmin1mRNA的帶有U6啟動(dòng)子的shRNA編碼框SEC(shRNAexpressingcassette)。設(shè)計(jì)引物從穿梭質(zhì)粒pAdTrack中克隆出帶有CMV啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因全序列(CMV-EGFP)，對(duì)pBluescriptII

11、KS(+)質(zhì)粒進(jìn)行熒光化改造，成功構(gòu)建用于RNA干擾的載體pBlue-EGFP-U6-si1/2/3并經(jīng)測(cè)序鑒定。 3、設(shè)計(jì)引物從人肺癌細(xì)胞A549中利用RT-PCR方法調(diào)取stathmin1基因全長(zhǎng)，電穿孔轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建克隆載體pAdTrack-stathmin1。蛋白質(zhì)在線數(shù)據(jù)庫(kù)SWISS-PROT設(shè)計(jì)Stathmin1C末端突變體，在pAdTraek-stathmin1基礎(chǔ)上成功構(gòu)建突變克隆載體pAdTrack-stath

12、min1-mut，并經(jīng)測(cè)序鑒定。 4、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染stathmin1克隆載體、突變載體以及RNA干擾載體到正常人黑色素細(xì)胞以及人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株中。分別觀察過(guò)表達(dá)、沉默或突變體stathmin1對(duì)CNE-2細(xì)胞以及黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。MTT法繪制不同stathmin1表達(dá)狀態(tài)下細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，Hoechst33258以及溴化乙啶(ethidiumbromide，EB)分別染色以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率改變，并對(duì)黑色素細(xì)

13、胞特有功能進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR以及Westernblot結(jié)果顯示干擾載體以及過(guò)表達(dá)載體能有效的在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平改變stathmin1的表達(dá)。間接免疫熒光法對(duì)CNE-2細(xì)胞β-Tubulin染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架形態(tài)改變。stathmin1的異常表達(dá)可以造成細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑，凋亡率顯著增加，基于微管的細(xì)胞骨架明顯受到破壞，黑色素產(chǎn)量以及酪氨酸酶活性明顯降低。 結(jié)論以及研究意義： 1、EB病毒永生化的

14、正常人B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，能不斷傳代，可以作為一種細(xì)胞模型用于某些疾病資料的保存。 2、對(duì)質(zhì)粒pBluescriptIIKS(+)熒光化改造成功，可以直接用于構(gòu)建針對(duì)其它基因的RNA干擾載體；正負(fù)向表達(dá)調(diào)控質(zhì)粒能有效改變stathmin1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，說(shuō)明RNA干擾靶點(diǎn)的選擇是基因特異的，3’端非翻譯區(qū)也可以存在有效靶點(diǎn)；突變載體和過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞stathmin1表達(dá)水平接近，表明C端三個(gè)氨基酸突變不會(huì)影響stath