皮下多發(fā)脂肪瘤致病相關(guān)基因分析.pdf

1、研究背景
　　 脂肪瘤(lipoma)是由成熟脂肪組織增生而形成的良性腫瘤，既有的大多數(shù)教科書認(rèn)為此病可發(fā)生于任何年齡，但多見(jiàn)于40～60歲的成年人。由于絕大多數(shù)的脂肪瘤不會(huì)惡變，無(wú)特殊不適癥狀和并發(fā)癥，易于診斷，治療手段單一(目前多以手術(shù)切除為主)，因此，對(duì)脂肪瘤的全面研究未能引起足夠的重視，其研究進(jìn)展也相對(duì)較慢。在臨床工作中，大多數(shù)醫(yī)生會(huì)注意到，對(duì)于單發(fā)脂肪瘤，手術(shù)基本可以治愈，預(yù)后良好，而對(duì)于皮下多發(fā)脂肪瘤患者，此病雖不至

2、于危及生命，但會(huì)使患者終日憂心于腫瘤的不斷進(jìn)展和苦于找不到徹底根治的方法和手段，從而嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。更為重要的是，隨著社會(huì)飛速進(jìn)步帶來(lái)的壓力增大、不良生活習(xí)慣增加及飲食結(jié)構(gòu)的變化，皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)病率異常增高，門診患者中此類疾病幾乎每日可見(jiàn)，而且大多數(shù)此病患者都具有父代或子代皆有發(fā)病的家族傾向，這就使得針對(duì)此病的研究顯得頗為重要和十分必要。
　　 20世紀(jì)90年代中后期，國(guó)外學(xué)者在軟組織腫瘤的細(xì)胞和分子遺傳學(xué)

3、研究中取得了突破性進(jìn)展，包括針對(duì)脂肪瘤的分子遺傳學(xué)研究，基本證實(shí)脂肪瘤細(xì)胞發(fā)生了染色體易位、重排或融合，這些遺傳學(xué)異常導(dǎo)致了相應(yīng)基因的突變和擴(kuò)增。研究結(jié)果顯示：55～57％的脂肪瘤病例存在染色體異常，主要涉及12q13-15，少數(shù)涉及6p21-23，或丟失13q中的一些成分。位于12q15區(qū)帶上的HMGIC基因(high mobility group IC gen，腫瘤相關(guān)基因高遷移率蛋白IC)重排，現(xiàn)認(rèn)為在脂肪瘤的發(fā)生過(guò)程中起了主要作

4、用。研究顯示，t(3:12)(q27-28；q13-15)導(dǎo)致位于12q15上的HMGIC基因與位于3q27-28上的LPP基因融合形成HMGIC-LPP融合基因，斷裂點(diǎn)分別為HMGIC基因?yàn)?號(hào)內(nèi)顯子，LPP基因?yàn)?號(hào)內(nèi)顯子。除t(3；12)(p27-28；q13-15)外，文獻(xiàn)上還報(bào)道了1例t(12；13)(q13-15；q12)，使HMGIC基因與LHFP基因發(fā)生融合。遺憾的是，這些染色體遺傳學(xué)改變后引起哪些相應(yīng)的基因發(fā)生變化，這

5、些變化基因的下游基因表達(dá)如何，其報(bào)道很少。從流行病學(xué)角度來(lái)看，目前，比較公認(rèn)的與脂肪瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的因素主要有如下幾種：1.遺傳因素，臨床中可見(jiàn)父代單發(fā)脂肪瘤，子代出現(xiàn)多發(fā)脂肪瘤或父代多發(fā)，而子代單發(fā)或多發(fā)的情況，這與上述染色體改變學(xué)說(shuō)剛好能夠互為呼應(yīng)；2.生活習(xí)慣不良，如過(guò)度飲酒、高脂飲食、熬夜等；3.生活或工作壓力過(guò)大。從文獻(xiàn)檢索來(lái)看，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于脂肪異常增生性疾病的研究更多傾向于多發(fā)性對(duì)稱性脂肪瘤病以及肥胖的研究，從這

6、些研究中也可以給我們一定的借鑒經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于染色體異常所導(dǎo)致的下游基因改變的研究具有相當(dāng)大的參考價(jià)值。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)信息檢索，國(guó)內(nèi)也有言論稱脂肪瘤致瘤因子是脂肪瘤形成的真正原因。提出這一理論的人員推測(cè)在脂肪瘤患者體細(xì)胞內(nèi)存在一種致瘤因子，在正常情況下，這種致瘤因子處于一種失活狀態(tài)(無(wú)活性狀態(tài))，不會(huì)發(fā)病，但在機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變時(shí)，由于體內(nèi)的淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)致瘤因子的監(jiān)控能力下降，加之慢性炎癥刺激、全身脂肪代謝異常等誘因條件下，脂肪瘤

7、致瘤因子活性進(jìn)一步增強(qiáng)與細(xì)胞內(nèi)的某些基因片斷結(jié)合，形成基因異常突變，導(dǎo)致脂肪組織沉積，最終形成脂肪瘤(http://www.clsbio.com)。筆者雖經(jīng)多方檢索，但遺憾的是未能找到針對(duì)此項(xiàng)論斷的專業(yè)文獻(xiàn)報(bào)道。但不可否認(rèn)的是，脂肪瘤和其它腫瘤一樣，是正常細(xì)胞通過(guò)一系列的基因改變而轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，這種改變可以是遺傳性或后天獲得性，在受到環(huán)境、飲食、輻射和病毒等因素影響引起染色體的變化，從而使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生異常，產(chǎn)生過(guò)量腫瘤相關(guān)蛋白或結(jié)

8、構(gòu)異常的蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞分裂和分化失控，通過(guò)多階段、多步驟轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。因此，目前我們已知的是，脂肪瘤的發(fā)病是多因素相互作用的結(jié)果，那么這些因素最終是如何導(dǎo)致脂肪瘤的發(fā)生?在脂肪瘤形成過(guò)程中到底是哪些基因發(fā)生了改變?又為什么只是瘤變而多不惡變哪?這些問(wèn)題的答案還未可知。
　　 針對(duì)上述問(wèn)題，本課題擬通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出脂肪瘤與正常脂肪組織之間存在的相關(guān)差異基因，以期闡釋皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)病機(jī)制，并為臨床治療提供可能的理論借鑒。

9、
　　 研究目的
　　 本研究旨在通過(guò)對(duì)皮下多發(fā)脂肪瘤患者的瘤體與周圍正常脂肪組織的基因差異分析，探索皮下多發(fā)脂肪瘤的相關(guān)基因表達(dá)，為臨床預(yù)防和治療提供可能的理論借鑒。
　　 研究方法
　　 一.樣本采集：來(lái)源為長(zhǎng)海醫(yī)院整形外科門診收治的男性皮下多發(fā)脂肪瘤患者，排除全身系統(tǒng)性疾病，平素體健，年齡≤60歲，全身瘤體數(shù)量≥5個(gè)，所有瘤體直徑≤3cm，發(fā)病時(shí)間≤2年，目的是為了便于捕捉脂肪瘤瘤變?cè)缙诘幕虮磉_(dá)差

10、異。同時(shí)采集瘤體周圍正常脂肪組織作為自體對(duì)照樣本，排除個(gè)體差異所造成的基因差異，縮小篩選范圍。
　　 二.實(shí)驗(yàn)分組：1.基因芯片檢測(cè)樣本采集自3個(gè)患者，共6個(gè)，包括脂肪瘤樣本3個(gè)(實(shí)驗(yàn)組，n=3)和脂肪瘤周圍正常脂肪組織樣本3個(gè)(對(duì)照組，n=3)；2.人群散發(fā)皮下多發(fā)脂肪瘤樣本和自體對(duì)照正常脂肪樣本各3個(gè)(n=3)。
　　 三.組織病理學(xué)分析：通過(guò)大體觀察、組織病理學(xué)切片HE染色、脂肪組織特殊染色、脂肪瘤內(nèi)血管及神經(jīng)分布

11、，觀察脂肪瘤與正常脂肪組織之間的形態(tài)學(xué)共性和個(gè)性。
　　 四.基因芯片差異基因篩選：應(yīng)用AffymetrixHumanU133Plus2.0芯片(人類全基因組芯片)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共6個(gè)樣本進(jìn)行基因檢測(cè)，所得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)SBC生物芯片分析系統(tǒng)進(jìn)行差異基因篩選，取差異倍數(shù)(foldchange)>2、p<0.05的基因?yàn)椴町惢颉?張基因芯片篩選出的差異基因按照實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行聚類分析，并根據(jù)分析結(jié)果對(duì)其功能進(jìn)行綜合分析，初步

12、篩選出6個(gè)可能與脂肪瘤發(fā)生、增殖、信號(hào)傳導(dǎo)等功能改變相關(guān)基因作為重要差異基因。
　　 五.相關(guān)基因不同樣本驗(yàn)證：將兩次取材的共6例實(shí)驗(yàn)組樣本及6例對(duì)照組樣本進(jìn)行6個(gè)重要差異基因的RT-PCR驗(yàn)證，排除及證實(shí)基因芯片結(jié)果的可靠性，并綜合基因芯片及RT-PCR兩種檢測(cè)方法所得6個(gè)基因表達(dá)量的差異和分子生物學(xué)功能，初步探討這些基因在脂肪瘤發(fā)生及發(fā)展中可能的作用及機(jī)制。
　　 研究結(jié)果
　　 第一部分、皮下多發(fā)脂肪瘤的組

13、織病理學(xué)分析
　　 本課題取材的多發(fā)脂肪瘤均具有完整包膜，包膜細(xì)薄，可見(jiàn)少量血管分布，瘤體色黃，有一定韌性，剖面見(jiàn)脂肪組織質(zhì)地較均一，結(jié)締組織間隔較少，將瘤體分隔為大小不一的小葉。瘤體周圍正常脂肪組織無(wú)包膜，被纖維間隔分隔成豆大的小葉狀，單位體積內(nèi)間隔成分較脂肪瘤組織明顯增多。鏡下見(jiàn)脂肪瘤組織內(nèi)主要由分化成熟的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，瘤體外周有薄的纖維組織間隔，纖維間隔向內(nèi)伸展，將瘤體分成各個(gè)大小不一的分葉，不同小葉間細(xì)胞大小也具有差異，

14、細(xì)胞擠壓呈圓形或多邊形，細(xì)胞內(nèi)含有大量脂滴脫失后形成的空泡，細(xì)胞核被擠壓偏位呈扁圓或新月狀。間隔內(nèi)有豐富的供血血管和其它類型細(xì)胞成分分布，小葉間排列緊密，小葉內(nèi)的脂肪細(xì)胞大小不一。正常脂肪組織纖維間隔豐富，組織松散，脂肪細(xì)胞形態(tài)大小較脂肪瘤組織更為均一相近，間隔成分主要為纖維結(jié)締組織。特殊染色顯示兩組的細(xì)胞內(nèi)脂滴油紅染色陽(yáng)性。
　　 第二部分、皮下多發(fā)脂肪瘤致病相關(guān)基因的基因組學(xué)分析
　　 6例樣本的基因探針結(jié)合總數(shù)為5

15、4614個(gè)，脂肪瘤組和正常脂肪組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示兩組差異結(jié)合探針總數(shù)共1776個(gè)(p<0.05)，其中差異倍數(shù)大于兩倍的差異探針結(jié)合數(shù)共374個(gè)。經(jīng)聚類分析，初篩p<0.05，F(xiàn)oldchange>2的差異基因共260個(gè)。與細(xì)胞增殖相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因差異數(shù)為36個(gè)，其中上調(diào)基因30個(gè)，下調(diào)基因6個(gè)；2個(gè)凋亡抑制基因ERBB4和NPY5R下調(diào)7倍和4.425倍；具有凋亡雙向調(diào)節(jié)功能的SOX4上調(diào)2.3118倍，具有抗凋亡作用的COM

16、P和HGF分別上調(diào)5.9558和3.366倍，具有凋亡誘導(dǎo)作用的PERP下調(diào)2.387倍；脂類結(jié)合基因10個(gè)，其中上調(diào)基因5個(gè)，下調(diào)基因5個(gè)；脂類儲(chǔ)存正性調(diào)節(jié)基因1個(gè)，即載脂蛋白B基因(APOB)下調(diào)7倍(p=0.0044)；脂類儲(chǔ)存負(fù)向調(diào)節(jié)基因ABCG1上調(diào)2.5倍。另外，與腫瘤細(xì)胞增殖及調(diào)控相關(guān)的幾個(gè)基因ESM1、SOX11及HOXD10等較正常脂肪組的表達(dá)量分別增高32.81倍、31.01倍及13.99倍。結(jié)合各個(gè)基因的生物學(xué)功能

17、和表達(dá)差異，篩選ESM1、SOX11、HOXD10、ERBB4、NPY5R及APOB進(jìn)行散發(fā)人群驗(yàn)證。
　　 第三部分、差異基因的散發(fā)人群驗(yàn)證
　　 應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證樣本的脂肪瘤組ESM1、SOX11、HOXD10、ERBB4、NPY5R及APOB的表達(dá)與基因組學(xué)分析結(jié)果基本一致，結(jié)果顯示六個(gè)基因的表達(dá)差異與基因芯片結(jié)果一致，并且每個(gè)樣本的變化特點(diǎn)與基因芯片的信號(hào)強(qiáng)度變化完全符合，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)此六個(gè)基因的差異

18、表達(dá)結(jié)果分別為：ESM1上調(diào)18.51倍，SOX11上調(diào)19.18倍，HOXD10上調(diào)20.55倍，ERBB4下調(diào)16.68倍，NPY5R下調(diào)4.99倍，APOB下調(diào)15.05倍。散發(fā)人群的PCR結(jié)果同樣顯示了與基因芯片相一致的變化規(guī)律，ESM1上調(diào)290.86倍，SOX11上調(diào)6.13倍，HOXD10上調(diào)11.2倍，ERBB4下調(diào)5.09倍，NPY5R下調(diào)7.19倍，APOB下調(diào)15.05倍。既驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，也驗(yàn)

19、證了這六個(gè)差異基因在散發(fā)人群中的表達(dá)差異是確實(shí)存在的。
　　 研究結(jié)論
　　 本課題應(yīng)用基因芯片對(duì)皮下多發(fā)脂肪瘤瘤體與自體正常脂肪之間的差異基因進(jìn)行初步篩選，并從中挑選出兩組差異倍數(shù)較大的致瘤相關(guān)基因3個(gè)(ESM1、SOX11、HOXD10)、細(xì)胞凋亡抑制基因2個(gè)(ERBB4和NPY5R)及脂類儲(chǔ)存調(diào)解基因1個(gè)(APOB)，通過(guò)熒光定量PCR方法在散發(fā)人群中進(jìn)行驗(yàn)證，初步證實(shí)皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)生是由于致瘤基因的異常高表達(dá)