A族鏈球菌FbaA蛋白單克隆抗體FbaA MAb2的功能研究.pdf

1、目的：A族鏈球菌（Group A Streptococcus;GAS），又稱化膿性鏈球菌，是一種全球范圍內(nèi)的人類重要致病菌。它能夠在人類的鼻咽部、皮膚和腸道組織中持續(xù)性存在，引起一系列感染，包括：急性咽炎、膿胞病、中毒性休克綜合癥、侵襲性筋膜炎、猩紅熱、肺炎、丹毒和GAS感染后引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病，如急性風濕熱（ARF）、風濕性心臟?。≧HD）、急性腎小球腎炎。GAS的感染在任何年齡段均可發(fā)生。特別對患有水痘的兒童，免疫系統(tǒng)被抑制的人群

2、，燒傷的病人，患有蜂窩組織炎、糖尿病、血管疾病、癌癥的老年人，接受類固醇藥物治療和化療的病人具有較大的威脅性。
　　 目前傾向于認為GAS是一種胞內(nèi)侵襲性細菌，能夠進入并持續(xù)性生存在哺乳動物細胞內(nèi)。有證據(jù)顯示，這種胞內(nèi)侵襲能夠幫助GAS抵抗免疫因素和抗生素對其的影響，使得GAS感染頻繁發(fā)生，這也是GAS能夠在宿主體內(nèi)播散的一個原因。GAS感染宿主的第一步就是黏附在宿主的上皮細胞上。最近的研究結(jié)果提示，黏附過程分為2步：第一步由脂

3、磷壁酸(LTA)介導的，GAS克服宿主細胞對其的靜電排斥力，表現(xiàn)出一種微弱的、可逆性的黏連。第二步是由組織特異性的M蛋白、F蛋白介導的牢固性的、不可逆性的黏連。FbaA蛋白和M蛋白具有相似的功能，Pandiripally等人的結(jié)果顯示，F(xiàn)baA蛋白具有借助補體調(diào)節(jié)蛋白FH/FHL-1介導GAS進入人類上皮細胞的功能，這意味著該蛋白有助于GAS在宿主細胞內(nèi)的存活。
　　 本室前期實驗發(fā)現(xiàn)FbaA蛋白具有很強的免疫原性，并且在小鼠體

4、內(nèi)誘導保護性免疫應(yīng)答，抵抗了GAS對小鼠的攻擊。為了進一步研究FbaA蛋白的生物學功能，并探索GAS的致病機制和感染后的治療策略，本室制備了抗FbaA蛋白的單克隆抗體—MAb2。前期研究結(jié)果顯示該抗體與FbaA+GAS菌顯示出高親和力的結(jié)合；另外，研究還發(fā)現(xiàn)MAb2結(jié)合FbaA的表位與補體調(diào)節(jié)蛋白FH結(jié)合FbaA蛋白的結(jié)合位點大部分重疊。為了進一步探討該單抗是否具有抗GAS感染的實用性，本研究將該單抗預先注射小鼠，再以致死量GAS對小鼠

5、進行攻毒，通過小鼠的存活率對FbaA MAb2在體內(nèi)中和GAS的能力進行評估；并通過免疫熒光實驗和侵襲實驗對FbaA MAb2能否阻止FH與GAS的結(jié)合進行了研究。
　　 方法：
　　 1.1將本室前期制備的能夠穩(wěn)定分泌FbaA MAb2的雜交瘤A8細胞通過亞克隆、全菌ELISA方法篩選出能夠分泌較高抗體滴度的細胞株，接種小鼠腹腔制備腹水。
　　 1.2將獲得的腹水倍比稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶1

6、6，加入菌液作試管凝集實驗。根據(jù)結(jié)果選定合適的稀釋度免疫動物。
　　 1.3單抗被動免疫對小鼠感染GAS的保護作用：將雌性BALB/c，8周齡小鼠，隨機分成4組，每組6只，分別為FbaA MAb2原液組、1/2稀釋組、1/4稀釋組和PBS菌液對照組。將單抗以不同濃度被動免疫小鼠后，用致死量GAS(M+FbaA+)標準菌株(7.5×107)攻擊各組小鼠，計算保護率。
　　 2.熒光顯微鏡觀察FH對GAS結(jié)合單抗的干擾作用：

7、收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的FbaA+GAS和FbaA-GAS，調(diào)整菌液濃度為108CFU/ml，分別加入l0ug/mlFH室溫結(jié)合，同時設(shè)立PBS對照。將菌液滴到載玻片上固定，再依次加入5ug/ml FbaA MAb2和FITC標記的羊抗鼠IgG二抗，熒光顯微鏡觀察。
　　 3.侵襲抑制實驗：在以上培養(yǎng)的菌株中依次加入FbaA MAb2，與菌共同作用30分鐘后加入FH，同時只加FH無單抗，以及無FH無單抗2個對照組。將預處理的菌復合

8、物加至A549細胞共同培養(yǎng)2小時后，洗去菌液，加入含有l(wèi)000U/ml青霉素，500U/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2小時后裂解細胞，將裂解液接種至鏈球菌培養(yǎng)固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，次日觀察并對菌落計數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.攻毒5天后，PBS組小鼠全部死亡，各實驗組連續(xù)觀察兩周后依然有多只小鼠存活。各組保護率：FbaA MAb2原液組和1/2稀釋組均為66.67％，F(xiàn)baA MAb21/4稀釋組為50％。經(jīng)過S

9、PSS10.0統(tǒng)計軟件分析各實驗組與PBS組保護率均有顯著差異。
　　 2.FbaA MAb2與FbaA+GAS能很好的結(jié)合，但不能與FbaA-GAS結(jié)合。預先加入FH能顯著降低FbaA MAb2與FbaA+GAS的結(jié)合。
　　 3.FbaA+GAS預先與FbaA MAb2作用，就能顯著減少FH介導的FbaA+GAS對A549細胞的侵入，表現(xiàn)為此組血平板的菌落形成數(shù)明顯少于只加入FH組的。
　　 結(jié)論：