慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默GTPBP4基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞HT29生物學(xué)行為影響的探究.pdf

1、目的：
　　利用pGC SIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29，沉默GTPBP4基因，探究GTPBP4RNAi對HT29細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.慢病毒最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的篩選及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　慢病毒GTPBP4RNAi載體及陰性對照慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因公司包裝完成;預(yù)實(shí)驗(yàn)用慢病毒轉(zhuǎn)染人HT29細(xì)胞篩選出

2、最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI），用篩選出的最佳MOI進(jìn)行正式轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，于轉(zhuǎn)染前一天鋪板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后熒光顯微鏡下觀察GFP標(biāo)記所激發(fā)出的熒光豐度，以此初步判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
　　2.Real-time PCR及Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后GTPBP4基因mRNA和蛋白水平的沉默效率
　　(1)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞7

3、2h后，分別提取實(shí)驗(yàn)組和對照組HT29細(xì)胞總RNA，根據(jù)Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用Real-time PCR檢測GTPBP4基因mRNA表達(dá)水平;
　　(2)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后，分別提取實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組總蛋白，采用Western blot檢測GTPBP4蛋白表達(dá)水平。經(jīng)蛋白變性、上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、化學(xué)發(fā)光，得到蛋白條帶并分析基因的沉默效率;
　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞生物

4、學(xué)行為的影響
　　(1)CCK-8法檢測沉默GTPBP4基因后，HT29細(xì)胞在體外增殖能力的改變：分別于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分板的24h、48h、72h、96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組兩組細(xì)胞在體外的增殖能力。
　　(2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默GTPBP4基因后單個(gè)細(xì)胞體外成瘤能力的變化。
　　(3)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測GTPBP4基因沉默后，對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29體外遷移能力產(chǎn)生的影響。
　　(4)Tra

5、nswell實(shí)驗(yàn)檢測GTPBP4基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29體外侵襲能力的影響。
　　(5)PI-FACS法檢測沉默GTPBP4基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖周期分布的影響。
　　(6)AnnexinV-APC單染法檢測GTPBP4基因沉默后，兩組細(xì)胞凋亡率的差別。
　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因?qū)53和Survivin蛋白表達(dá)量及定位的影響
　　利用Western blot和免疫熒光技術(shù)，檢測慢病毒轉(zhuǎn)染人結(jié)

6、腸癌細(xì)胞HT29沉默GTPBP4基因?qū)53和Survivin蛋白表達(dá)量及定位的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MOI的篩選
　　GTPBP4RNAi轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的MOI值為10.
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后，GTPBP4基因mRNA水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低。
　　(1)采用2-△△Ct法統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組中GTPBP4基因mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：顯示：實(shí)驗(yàn)組GTPBP4mR

7、NA相對表達(dá)量為0.026±0.01，陰性對照組GTPBP4mRNA相對表達(dá)量為0.993±0.06，且兩組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，故GTPBP4RNAi能夠有效地抑制mRNA的表達(dá)。
　　(2)Western blot結(jié)果：在內(nèi)參蛋白條帶灰度基本一致的條件下，實(shí)驗(yàn)組GTPBP4蛋白條帶灰度明顯低于陰性對照組。
　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　(1)CCK-8結(jié)果：在轉(zhuǎn)

8、染后分板的24h、48h、72h、96h，實(shí)驗(yàn)組測得的OD值均值分別為0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.01±0.06，陰性對照組OD值均值分別為0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09，實(shí)驗(yàn)組OD值小于對照組，且兩組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組較陰性對照組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低。
　　(2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：種板2周后，實(shí)驗(yàn)組生成細(xì)胞集落個(gè)數(shù)均數(shù)為6

9、7.00±3.61，對照組生成細(xì)胞集落個(gè)數(shù)均數(shù)為115.70±10.02，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落個(gè)數(shù)明顯少于陰性對照組，且兩組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)劃痕實(shí)驗(yàn)：在劃痕48h后，實(shí)驗(yàn)組融合平均距離為500.01±1.82PX（像素），陰性對照組融合平均距離為781.23±10.51PX（像素），實(shí)驗(yàn)融合距離明顯小于陰性對照組。
　　(4)Transwell實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種的48h，固定染色后，實(shí)驗(yàn)組穿過Matri

10、gel膠的細(xì)胞數(shù)目均數(shù)為91.40±4.39，陰性對照組穿過Matrigel膠細(xì)胞數(shù)目均數(shù)為263.80±11.90，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目明顯小于陰性對照組，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(5)細(xì)胞周期結(jié)果：與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組處于G1的細(xì)胞數(shù)目比例顯著增加，而處于S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少。
　　(6)細(xì)胞凋亡結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡比例明顯高于陰性對照組。
　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因?qū)53和Su

11、rvivin蛋白表達(dá)量及定位的影響
　　在目的基因GTPBP4沉默的條件下，p53蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而Survivin蛋白表達(dá)明顯下調(diào);熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組的p53，Survivin蛋白均在核表達(dá)，并沒有發(fā)生表達(dá)位置的改變。
　　結(jié)論：
　　1.pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體能夠感染人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，并且有效沉默GTPBP4基因。
　　2.HT29細(xì)胞GTPBP4基