皮膚源祖細胞對去神經皮膚創(chuàng)面愈合作用的研究.pdf

1、截癱病人引起的褥瘡和糖尿病外周神經病變所致糖尿病足是臨床上最常見的慢性創(chuàng)面。近年來，機體組織創(chuàng)傷伴所支配神經受損的慢性創(chuàng)面發(fā)生率呈上升趨勢，而對于慢性創(chuàng)面的愈合機制和治療一直是醫(yī)學界有待解決的問題。目前關于創(chuàng)面愈合機制的研究很多，但是關于去神經支配的慢性創(chuàng)面愈合的機制鮮有報道。有研究表明，在創(chuàng)面修復過程中，皮膚神經的再生是重要的環(huán)節(jié)，但神經損傷是否對創(chuàng)面愈合有影響卻莫衷一是。 皮膚源祖細胞 (skin-derived precu

2、rsors，SKPS) 是一類分布于表皮基底層和毛囊隆突部的干細胞，具有神經元干細胞的特性。國外有學者根據(jù)SKPs能夠在體外分化成為神經元和神經膠質細胞的特性，將其應用于中樞神經系統(tǒng)神經修復的實驗研究，結果表明SKPs可重塑損傷的神經髓鞘。這為SKPs在神經系統(tǒng)疾病的細胞治療方面帶來了廣闊的前景。 在此基礎上，本次課題通過將培養(yǎng)的皮膚源祖細胞應用于去神經創(chuàng)面治療，以觀察皮膚源祖細胞對去神經創(chuàng)面細胞增殖活性、血管和神經再生的情況。

3、 第一部分皮膚源祖細胞體外誘導神經元樣細胞的實驗研究 目的探討皮膚源祖細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及定向誘導成神經元的方法，為治療神經系統(tǒng)疾病提供理想的種子細胞。方法取出生1～3d的昆明鼠皮膚，分離培養(yǎng)出皮膚源祖細胞；皮膚源祖細胞以含bFGF和10％FBS的培養(yǎng)基中預誘導24h，再以含DMSO和BHA的培養(yǎng)基中誘導7d；觀察誘導細胞形態(tài)，免疫熒光鑒定細胞表達NF、NSE和GFAP情況；ELISA檢測誘導細胞分泌NGF和BDNF情

4、況。結果細胞誘導后呈多極性生長；細胞免疫熒光表達NF和NSE，GFAP表達陰性；隨誘導時間延長培養(yǎng)液中BDNF和NGF濃度增加。結論皮膚源祖細胞在特定條件下能定向分化為神經元，并且能提高神經生長因子和腦源性神經營養(yǎng)因子的分泌，能為組織工程皮膚和修復神經系統(tǒng)病變提供種子細胞。 第二部分去神經支配對大鼠創(chuàng)面愈合的影響目的通過制備去神經支配大鼠創(chuàng)面模型，觀察去神經大鼠創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面血管和皮膚增殖改變情況，為去神經創(chuàng)面愈合機制提供理論

5、依據(jù)。方法分離并切斷SD大鼠胸9～腰1右側脊神經，造模后在背部對稱制作兩個直徑為1.0cm的圓形創(chuàng)面，分別觀察兩側創(chuàng)面愈合時間、創(chuàng)面大體和組織形態(tài)學、創(chuàng)面細胞增殖活性、創(chuàng)面修復過程中血管再生情況，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果實驗組愈合時間在4w，對照組為 3w；實驗組創(chuàng)面上皮化速度慢于對照組；實驗組愈合表皮層較薄，上皮細胞大小不一；愈合時真皮和表皮層細胞增殖活躍，2～4w時實驗組增殖活性低于對照組 (p<0.05)；創(chuàng)面微血管主要分布于真

6、皮層，密度隨愈合時間增加，但2～4w實驗組表現(xiàn)較實驗組弱 (p<0.05)。結論去神經后皮膚創(chuàng)面細胞增殖低下，愈合時間延長，血管再生現(xiàn)象受到抑制。 第三部分皮膚源祖細胞對去神經皮膚創(chuàng)面愈合的作用目的通過將皮膚源祖細胞應用于裸鼠失神經支配創(chuàng)面，探索組織修復創(chuàng)面愈合的機制，同時為去神經創(chuàng)面的治療提供新的實踐依據(jù)和思路。方法 30 只裸鼠制作雙側去神經模型后，在失神經區(qū)域制作直徑大小為0.5cm的圓形創(chuàng)面，第 3 代昆明鼠皮膚源祖細胞

7、四點注射至創(chuàng)面，治療后1w、2w和3w留取創(chuàng)面組織標本，對創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面細胞增殖活性、血管和神經再生進行檢測。結果實驗組上皮化速度明顯較對照組加快，表皮層細胞較厚，2w時實驗組創(chuàng)面完全愈合，對照組愈合時間為3w，愈合后創(chuàng)面收縮較實驗組明顯；愈合過程中創(chuàng)面細胞增殖活躍，3w時增殖現(xiàn)象減弱，各時間點增殖活性實驗組明顯強于對照組； 神經再生主要位于真皮層小血管附近，可見串珠狀或波紋狀彎曲的細小神經分支，實驗組表達高于對照組；新生血管