大鼠表皮干細(xì)胞體外培養(yǎng)和α-MSH及MC1R表達(dá)研究.pdf

1、研究背景：
　　表皮干細(xì)胞（EpSCs，Epidermal stem cells）自發(fā)現(xiàn)以來一直是研究的熱點，作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，具有高度的自我更新能力及多向分化潛能，其不僅維持皮膚日常的新陳代謝及皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而且與創(chuàng)面修復(fù)緊密相連。當(dāng)受到外界損傷刺激時，EpSCs可主動參與損傷皮膚的修復(fù)，通過脫粘附、遷移、增殖，并向表皮終末細(xì)胞分化，誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞向創(chuàng)面爬行，進(jìn)而覆蓋創(chuàng)面，促進(jìn)再上皮化，最終達(dá)到修復(fù)創(chuàng)面的目的。

2、
　　α-促黑素（α-MSH，α-melanocyte stimulating hormone）最初被人們發(fā)現(xiàn)是因其在促進(jìn)黑素生成、調(diào)節(jié)皮膚色素沉著方面的作用。近年來大量研究證實，α-MSH在抗炎、退熱、抗菌、營養(yǎng)神經(jīng)、能量平衡、調(diào)節(jié)心血管功能、影響動物生物學(xué)行為及維持免疫功能相對穩(wěn)定等方面都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。α-MSH通過與黑皮素受體（melanocortin receptor，MCR）結(jié)合發(fā)揮其生理功能。MCR是一個G蛋白

3、偶聯(lián)型受體，至今已有5種 MCR被克隆和定性，皮膚中發(fā)現(xiàn)的主要是MC1R（Melanocortin1 receptor，MC1R）、MC2R（Melanocortin2 receptor，MC2R）及MC5R（Melanocortin5 receptor，MC5R）。已發(fā)現(xiàn)MC1R在黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、真皮免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等幾乎所有類型的皮膚組織細(xì)胞中均有表達(dá)，且與這些細(xì)胞的關(guān)系最為密切。

4、r>　　本實驗從大鼠皮膚基底層分離培養(yǎng)出EpSCs，并進(jìn)行鑒定；同時檢測EpSCs中α-MSH及其受體MC1R的表達(dá)情況，為研究α-MSH對EpSCs的調(diào)控作用等后續(xù)實驗打下基礎(chǔ)，以便進(jìn)一步豐富完善創(chuàng)面修復(fù)的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用。
　　方法：
　　1．實驗以新生 SD大鼠背部皮膚為材料，采用“胰酶兩步消化+IV型膠原差速貼壁法”分離純化原代大鼠EpSCs，無血清低鈣培養(yǎng)基為其提供營養(yǎng)。
　　2．采用免疫化學(xué)技術(shù)：細(xì)胞免疫

5、熒光（Immunofluorescence，IF）、蛋白印記法（Western Blotting，WB）、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometric，F(xiàn)CM）檢測EpSCs表面標(biāo)記物β1-整合素、α6-整合素、角蛋白19（Cytokeratin19，K19）及CD71的表達(dá)情況，確定其是否符合EpSCs標(biāo)準(zhǔn)。
　　3．通過IF單染和雙染法檢測大鼠EpSCs中α-MSH及其受體MC1R的表達(dá)情況，并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reve

6、rse transcription polymerase chain Reaction，RT-PCR）檢測受體MC1R的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1．倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞培養(yǎng)2-3天，即有小克隆形成，并呈不規(guī)則橢圓形；培養(yǎng)4-5天，細(xì)胞增殖明顯加快，克隆變大；培養(yǎng)7-8天，細(xì)胞融合至70-80％，形成鋪路石狀，折光性好。
　　2．檢測大鼠 EpSCs的表面標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)：WB檢測培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)β1-整合素；共聚焦顯

7、微鏡下觀察，細(xì)胞可同時表達(dá)K19和β1；FCM檢測結(jié)果顯示，2代EpSCs高表達(dá)α6，低表達(dá)CD71。
　　3．IF檢測到EpSCs表達(dá)α-MSH；免疫熒光雙標(biāo)法發(fā)現(xiàn)，K19與MC1R、α6與MC1R表達(dá)均呈陽性；RT-PCR顯示體外培養(yǎng)的EpSCs表達(dá)受體 MC1R及α-MSH的前體及合成酶。
　　結(jié)論：“胰酶兩步消化+IV型膠原差速貼壁法”可獲得形態(tài)均一、活力好、純度較高的大鼠EpSCs；體外培養(yǎng)的大鼠表皮干細(xì)胞表達(dá)α-