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文檔簡介
1、背景與目的:肝癌是全世界發(fā)病最多的癌癥之一。許多危險因素與肝癌的發(fā)生和發(fā)展相關,包括慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染、慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、飲食中黃曲霉毒素B1超量、飲酒過量和非酒精性脂肪性肝硬化。由于HCC的發(fā)病率的逐年提升,越來越多的研究著力于探究肝癌發(fā)生的細胞水平和分子水平的機制,希望能找到新的診斷肝癌的生物學標記物和治療靶點。
本次研究在HBV相關的肝癌中監(jiān)測了miR-545/374a和miR-421/374b
2、的表達情況。通過與臨床指標間的分析,希望探究microRNA調控腫瘤進展的作用。體外細胞培養(yǎng)模型用于確認microRNA的生物學效應,并探究相關的調控機制。然后,遵從一個“從組織到血清,從術前到術后”的思路,探究了血清中的相應的microRNA的臨床應用價值。
第一部分 Ftx lncRNA編碼的microRNA在人類HBV相關的肝癌組織中的表達,及其與預后相關的臨床指標的相關性
目的:1.探究Ftx編碼的miR-5
3、45、miR-374a、miR-421、miR-374b在人類HBV相關的肝癌組織中的表達變化;
2.選取與腫瘤的進展和疾病預后相關的關鍵性臨床指標探究在肝癌組織中發(fā)生差異表達的microRNA與它們的相關關系。
方法:1.選取在2012年2月份到2013年1月份于山東大學附屬山東省立醫(yī)院行肝癌切除術的66例乙肝相關的肝癌病人,收集其腫瘤組織和遠端無腫瘤肝臟組織;選取11例行肝血管瘤切除術的病人(陰性對照),收集其肝
4、臟組織;超低溫保存組織標本以備檢測;
2.采用實時定量PCR檢測組織標本中miR-545、miR-374a、miR-421、miR-374b的表達;
3.對HBV-HCC患者的腫瘤標本進行病理學分析,評價腫瘤的組織學分級、轉移、腫瘤包膜完整性和肝硬化情況;
4.One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test用于檢驗實驗定量數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布;配對t檢驗用于比較microRNA的表達量在配
5、對的HBV-HCC組織和無腫瘤組織中的差異;不配對的組織采用獨立t檢驗;Pearson分析用于檢驗相關性;P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
結果:1.Ftx編碼的mr-545/374a在HBV-HCC組織中的表達發(fā)生了上調
2.miR-545/374a的表達與預后有關的臨床指標明顯相關為了探究miR-545/374a在HBV相關的肝癌中起的作用,選取了與腫瘤的進展和疾病預后相關的關鍵性的臨床指標,分析miR-545/
6、374a與這些指標是否具有相關性。
結論:1.Ftx編碼的miR-545/374a在HBV-HCC組織中的表達發(fā)生了上調;
2.miR-545/374a的表達與腫瘤組織分化、轉移、腫瘤包膜完整性相關,提示miR-545/374a的高表達可能促進腫瘤侵襲和遠端轉移,從而導致患者的預后不良。
第二部分 HBV感染誘發(fā)miR-545/374a上調,并促進腫瘤的發(fā)展
目的:1.分析miR-545/374a
7、與慢乙肝感染相關的臨床指標HBsAg、 HBV-DNA是否相關;
2.探究HBV感染對miR-545/374a表達的影響;
3.探究HBx蛋白對miR-545/374a的調控作用;
4.探究miR-545/374a過表達對于腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力的影響。
方法:1.培養(yǎng)人類肝癌細胞系Bel-7402、HepG2、穩(wěn)定的HBV陽性表達的細胞系HepG2.2.15;按照密度2.0xi05個細胞/m
8、L種植細胞到六孔板中,轉染前無血清饑餓24小時;
2.野生型的編碼HBV全基因組的質粒pCDNA3.1-HBV,或者編碼HBx蛋白全長的質粒pIRSE-HBx,以LipofectamineTM2000為介質轉染到細胞中,空白表達的質粒作為對照組;采用高敏熒光實時定量PCR和蛋白印記驗證質粒轉染成功;
3.GenePharma合成的miR-545的類似物、抑制物、miR-374a的類似物、抑制物,以及他們的陰性對照寡核
9、苷酸鏈以Lipofectamine2000為介質轉染到細胞中,無義寡核苷酸鏈作為對照;
4.采取細胞增殖實驗探究miR-545/374a的過表達對細胞增殖能力的影響,采用覆蓋Matrigel的transwell小室實驗來探究細胞侵襲能力,采用不覆蓋matrigel的transwell小室實驗來進行探究細胞遷移能力;
5.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件用于實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學意義通過獨立組間學生t檢驗,P<
10、0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
結果:1.HBV感染對miR-545/374a表達水平的影響
2.HBx蛋白對miR-545/374a表達的調控作用HBx蛋白是HBV感染過程中一個關鍵的調控因子。因此,我們監(jiān)測了HBx蛋白在66對HBV相關的肝癌組織和癌旁組織中的表達情況。
3.miR--545/374a高表達對于肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響
結論:1.HBeAg指標陽性或者HBV-DNA陽
11、性的患者,miR-545/374a表達水平較陰性患者升高;
2.HBV感染能夠上調miR-545/374a的表達,HBx是這個過程中的關鍵調控因子;
3.miR-545/374a高表達能夠促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。
第三部分 血清中miR-545/374a的表達與組織的對應關系,及其在臨床診斷中的價值
目的:1.探究血清miR-545/374a表達與肝癌組織miR-545/374a表達的對應
12、關系;
2.探究HBV相關的肝癌患者血清miR-545/374a的表達水平與陰性對照之間的差異,評價miR-545/374a診斷腫瘤發(fā)生的臨床意義;
3.探究血清miR-545/374a在腫瘤切除術前、術后的變化趨勢;
4.分析術前血清中miR-545和miR-374a的表達量與患者預后相關的臨床指標的關系。
方法:1.收集66例HBV相關的肝癌患者的血液標本,包括術前5ml靜脈血、手術20天以后
13、復查的5ml靜脈血,低溫保存待檢;
2.收集患者的年齡、性別、HBV-DNA、甲胎蛋白(AFP),癌胚抗原(CEA),gamma谷胱甘肽(γ-GT)等臨床指標,以備相關性檢驗;
3.配對t檢驗用于比較microRNA的表達量在術前、術后血清中的差異,不配對的組織采用獨立t檢驗;Pearson分析用于檢驗相關性;P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
結果:1.HBV相關的肝癌患者血清中的miR-545/374a表
14、達情況,及其與組織表達的對應關系
2.血清miR-545/374a在腫瘤切除術前、術后的變化趨勢
結果顯示,miR-545的表達降低了47.3%(p=0.001),而miR-374a的表達降低了45.8%(p=0.042),這進一步證實了血清miR-545/374a是腫瘤來源的。每個患者術前和術后miR-545/374a水平的連線圖就像之前假設的那樣,幾乎所有的患者的miR-545/374a表達水平都發(fā)生了下調。
15、r> 3.術前血清中miR-545和miR-374a的表達水平與患者預后/診斷相關的臨床指標的相關分析
用實時定量PCR檢測了66例HBV相關的肝癌組織中miR-545和miR-374a的表達,分析它們與預后/診斷相關的指標的相關性。每一個分化等級的肝癌患者與陰性對照患者相比,他們血清中miR-545和miR-374a的水平都有明顯的差異,但是不同的分化等級的患者組中,沒有觀察到有統(tǒng)計學意義的差異的差別。發(fā)生轉移的肝癌患者和
16、沒有發(fā)生轉移的肝癌患者相比,他們的血清中miR-545和miR-374a的水平沒有明顯的差異。接下來,我們分析了三個已經建立的比較完善的預測肝癌腫。AFP陽性(≥20ng/ml)的患者比AFP陰性的患者,miR-545/374a的表達水平明顯較高(p=0.012,p=0.009,independent t test)。然而,miR-545/374a的表達水平和CEA或者γ-GT沒有明顯的相關性。
結論:1.HBV相關的肝癌患者
17、中,血清miR-545和miR-374a的表達明顯上調,且其表達與肝癌組織中的表達相一致,證明血清miR-545/374a的表達能夠提示HBV相關的肝癌的發(fā)生;
2.腫瘤切除術后,肝癌患者的血清中miR-545和miR-374a的表達發(fā)生了明顯下調,提示血清miR-545和miR-374a是腫瘤來源的;
3.AFP陽性的患者相較AFP陰性的患者,miR-545/374a的表達水平明顯較高;但miR-545/374a的
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