乙醛脫氫酶2對(duì)代謝綜合征小鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：目前，心腦血管病已經(jīng)在發(fā)展中國(guó)家開(kāi)始蔓延，成為世界首位的死亡原因，嚴(yán)重地危害著人類的生命和健康，而心力衰竭作為各種心臟病發(fā)展的嚴(yán)重階段，正在成為本世紀(jì)最重要的心血管病癥。有流行病學(xué)資料顯示，全球心衰患者的數(shù)量以每年約200萬(wàn)的速度遞增，并且心衰的病死率高，5年存活率與惡性腫瘤接近。現(xiàn)已明確，各種原因引起的心肌重構(gòu)是導(dǎo)致心衰發(fā)生發(fā)展的基本病理生理基礎(chǔ)。
　　心肌重構(gòu)是由一系列復(fù)雜的分子及細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的

2、變化。其心肌生物學(xué)特征改變包括:心肌細(xì)胞凋亡;病理性心肌細(xì)胞肥大;心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解增加或過(guò)度纖維化。其心臟幾何學(xué)特征改變?yōu)?心肌重量和心室容量的增加;心室形狀的改變;心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致心功能失代償，即心力衰竭。臨床多種疾病均可導(dǎo)致心肌重構(gòu)，如高血壓、糖尿病、肥胖、冠心病、瓣膜病等。
　　近年來(lái)，肥胖及糖、脂代謝紊亂等非血流動(dòng)力學(xué)因素對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用日益受到重視。代謝綜合征(Metabolic syndrome，

3、MS)為肥胖、血脂紊亂、高血壓、血糖調(diào)節(jié)受損或胰島素抵抗等多種心血管疾病危險(xiǎn)因素的簇集。MS及其各組分均可對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能造成顯著的影響，其中以左心室結(jié)構(gòu)改變?yōu)樽钤缙诤妥钔怀龅谋憩F(xiàn)，有研究表明，左室結(jié)構(gòu)改變是心臟病患者病死率上升的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前，MS在我國(guó)發(fā)病率逐年上升，因此，防治MS心肌重構(gòu)已成為治療的首要目標(biāo)。預(yù)防MS所致心肌損傷、延緩左室重構(gòu)，可改善心力衰竭的長(zhǎng)期臨床預(yù)后。
　　乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehyd

4、rogenase，ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶，能夠?qū)⒏鞣N外源性和內(nèi)源性醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸，減少醛類物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。研究表明，心臟缺血-再灌注損傷過(guò)程中，ALDH2活性與心肌梗死面積高度負(fù)相關(guān)，提示ALDH2具有重要的心肌保護(hù)作用;另有研究顯示，ALDH2可通過(guò)代謝4-HNE等毒性醛類而在心肌梗死過(guò)程中起到抗心肌細(xì)胞凋亡并改善心室重構(gòu)的作用。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者在ALDH2心肌保護(hù)方面開(kāi)展了部分研究，但MS導(dǎo)致的心肌損傷

5、、重構(gòu)是否與ALDH2的表達(dá)和活性抑制有關(guān)，過(guò)表達(dá)ALDH2是否可以起到MS心肌的保護(hù)作用，其作用是否與調(diào)控JNK/AP-1有關(guān)，迄今未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，推測(cè):MS導(dǎo)致的心肌損傷重構(gòu)過(guò)程與內(nèi)源性ALDH2表達(dá)和活性的下降有關(guān)，過(guò)表達(dá)或增強(qiáng)ALDH2活性可以起到干預(yù)MS心肌重構(gòu)，改善心功能，進(jìn)而起到MS心肌的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與ALDH2減輕氧化應(yīng)激，調(diào)控JNK/AP-1表達(dá)，改善胰島素抵抗，減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化

6、有關(guān)。
　　本課題立足于ALDH2與MS心肌保護(hù)之間存在著密切關(guān)系，以心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化為切入點(diǎn)，我們采用高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠模型，超聲和組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)與功能異常，明確MS小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系;過(guò)表達(dá)ALDH2，進(jìn)而探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌重構(gòu)發(fā)展過(guò)程中JNK/AP-1及心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化等重要因子表達(dá)的影響，不僅有助于闡明ALDH2干預(yù)MS心肌重構(gòu)的內(nèi)在分子機(jī)制，而且可以為該酶靶點(diǎn)

7、的心肌保護(hù)作用提供新的思路和治療策略。
　　研究目的：1.高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠心肌重構(gòu)，評(píng)價(jià)MS小鼠心肌重構(gòu)的特征改變;
　　2.觀察MS小鼠心肌ALDH2表達(dá)及活性變化趨勢(shì)，探討ALDH2活性是否與心功能EF值呈正相關(guān);
　　3.評(píng)價(jià)ALDH2對(duì)MS小鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化的影響，探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用;
　　4.探討ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的具體分子作用機(jī)制，為臨床干預(yù)MS

8、心肌重構(gòu)提供新的治療靶點(diǎn)。
　　研究方法：高脂飲食誘導(dǎo)建立MS小鼠模型:將90只雄性C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=15只)和模型組(n=75只)。NC組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);模型組以高脂飼料喂養(yǎng)。飼料具體配方構(gòu)成比為基礎(chǔ)料61％，豬油27.5％，酪蛋白8.5％，膽固醇1.2％，膽酸鈉0.2％，磷酸氫鈣0.6％，石粉0.6％，添加劑0.4％。喂養(yǎng)10周后將造模成功的55只MS小鼠隨機(jī)分為三組:MS組(n=15只)，

9、繼續(xù)以高脂喂養(yǎng);ALDH2載體組(n=20只)，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，并左心室注射ALDH2慢病毒載體;GFP組(n=20只)，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，并左心室注射不攜帶ALDH2重組基因的GFP載體。轉(zhuǎn)染慢病毒載體4周后，處死動(dòng)物，留取心臟組織備用。
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行以下指標(biāo)監(jiān)測(cè):(1)每2周應(yīng)用電子秤測(cè)量小鼠體重。(2)小鼠開(kāi)始喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染病毒載體4周后，檢測(cè)血清總膽固醇(Totalcholesterol，TC)、甘油三酯(Tri

10、glycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)以及胰島素(Fasting blood insulin，F(xiàn)INS)，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)價(jià)指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR, HOMA-IR=FB

11、GxFINS/22.5)。(3)小鼠開(kāi)始喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染載體4周后，應(yīng)用高分辨顯微超聲儀測(cè)量小鼠舒張末期左室內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)，并計(jì)算左室質(zhì)量(left ventricular mass，LVM)、射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF)及左

12、室短軸縮短率(Left ventricular short axis reduced rates，F(xiàn)S)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，留取心臟標(biāo)本，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn):(1)分光光度法測(cè)定線粒體ALDH2活性。(2)透射電鏡檢測(cè)小鼠心肌超微結(jié)構(gòu);心肌組織病理學(xué)檢測(cè)(HE染色、Masson染色)心肌結(jié)構(gòu)及心肌纖維化。(3) TUNEL法檢測(cè)左室心肌細(xì)胞的凋亡率;JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。(4) DCF法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。(

13、5)免疫組化染色檢測(cè)心肌組織4-HNE含量。(6)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá)，β-actin基因用作內(nèi)參基因。(7) Western blot法檢測(cè)p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)、IRS-1、p-AKT、AKT、caspase-3以及ALDH2蛋白表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，應(yīng)用SPSS17.

14、0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，干預(yù)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);三組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間兩兩比較采用LSD(Least significant difference)檢驗(yàn);各指標(biāo)間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：1.MS小鼠模型成功建立
　　在模型建立過(guò)程中，模型組小鼠共死亡5只，并剔除不符合MS標(biāo)準(zhǔn)的小鼠后，最

15、終55只成模，正常對(duì)照組無(wú)死亡。轉(zhuǎn)染后， ALDH2載體組及GFP組各死亡6只，陽(yáng)性對(duì)照組死亡1只，最終共57只小鼠完成實(shí)驗(yàn):NC組(n=15只)，MS組(n=14只)，ALDH2載體組(n=14只)，GFP組(n=14只)。
　　C57 BL/6J小鼠高飼喂養(yǎng)10周后，表現(xiàn)出明顯的MS特征。與NC組比較，模型組小鼠體重增加，血清TC、TG、LDL-C、FBG及FINS增高，計(jì)算HOMA-IR升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

16、。表明經(jīng)10周高飼喂養(yǎng)，已成功建立了MS小鼠模型。
　　2.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠各項(xiàng)代謝指標(biāo)及體重
　　轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體4周后，與MS組及GFP組比較，ALDH2載體組血清FBG、FINS水平下降，計(jì)算HOMA-IR降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);體重、TG、TC、LDL-C有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.各組小鼠心肌ALDH2活性及蛋白表達(dá)的變化
　　與NC組小

17、鼠比較，MS組小鼠心肌線粒體ALDH2活性明顯下降(P＜0.01);其ALDH2活性下降約40％;與NC組小鼠比較，MS組小鼠ALDH2蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體后，小鼠心肌ALDH2蛋白表達(dá)及活性明顯升高(P＜0.01)。
　　4.轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體對(duì)MS小鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　MS組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于NC組小鼠(P＜0.01)，而ALDH2組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平

18、較MS組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。4-HNE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MS組小鼠心肌4-HNE含量高于NC組小鼠（P＜0.01）;與MS組和GFP組相比較，ALDH2組小鼠4-HNE含量明顯下降(P＜0.01)。提示ALDH2活性及蛋白表達(dá)增高，可有效清除4-HNE，進(jìn)而改善小鼠心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　5.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能
　　與NC組相比，MS組小鼠LVEDD及LVESD顯著增加(

19、P＜0.01)，EF及FS顯著下降(P＜0.01)。與MS組和GFP組相比，ALDH2組小鼠LVEDD及LVESD顯著下降，且EF及FS顯著提高(P＜0.05)。
　　6.ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心肌形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)
　　HE染色結(jié)果顯示，與NC組比較，MS組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)肌纖維斷裂。與MS組及GFP組比較，ALDH2載體組心肌結(jié)構(gòu)紊亂有所改善。
　　透射電鏡結(jié)果顯示，NC組可見(jiàn)肌纖維沿長(zhǎng)軸整齊排列

20、，肌小節(jié)及明暗帶清晰規(guī)則;線粒體豐富，大小較一致;細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)成纖維細(xì)胞和少量膠原纖維。MS組及GFP組肌纖維排列紊亂，Z線消失明顯;胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體腫脹、空泡化，自噬體出現(xiàn)，可見(jiàn)凋亡小體;間質(zhì)充滿增生的膠原纖維，膠原纖維走形紊亂，斷裂。與MS組及GFP組相比，ALDH2組肌纖維的排列較為整齊，線粒體腫脹、空泡化明顯改善;膠原纖維明顯減少，排列相對(duì)整齊。
　　7.ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1表達(dá)，影響IRS-1

21、/AKT/caspase3通路以減少心肌細(xì)胞凋亡
　　TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核可被染色為棕褐色或棕黃色的顆粒。TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞在NC組小鼠心肌細(xì)胞中數(shù)量極少，而在MS組小鼠心肌細(xì)胞中明顯增多，有顯著性差異(P＜0.01);與MS組及GFP組相比，ALDH2組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，有顯著性差異(P＜0.01)。
　　JC-1檢測(cè)線粒體膜電位變化:與NC組比較，MS組及GFP組小鼠線粒體膜電位

22、明顯下降(P＜0.01)。與MS組及GFP組比較，ALDH2組線粒體膜電位升高(P＜0.05)。
　　Western blot法檢測(cè)重要因子蛋白表達(dá):與NC組比較，MS組及GFP組p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)、IRS-1、caspase-3蛋白表達(dá)升高，p-AKT/AKT蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與MS組及GFP組比較，ALDH2組p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser307)

23、、caspase-3蛋白表達(dá)下降，p-AKT/AKT蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　8.ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)抑制TGF-β1/膠原合成以減少心肌纖維化
　　Masson染色結(jié)果顯示，NC組的心肌間質(zhì)膠原組織排列整齊，分布較均勻;與NC組相比，MS組和GFP組膠原纖維明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維排列紊亂甚至斷裂;與MS組及GFP組相比，ALDH2組膠原纖維則明顯減

24、少，排列較規(guī)則整齊。膠原定量分析顯示: MS組心肌CVF升高，膠原相對(duì)含量較NC組明顯增多(P＜0.01);ALDH2組膠原相對(duì)含量較MS組明顯減少(P＜0.05)。
　　RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá):與NC組比較，MS組及GFP組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與MS組及GFP組比較，ALDH2載體組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原ⅢmRNA

25、表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：(1)通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)C57 BL/6小鼠可誘導(dǎo)與人類MS相類似的MS模型。該模型存在左室結(jié)構(gòu)改變、心肌細(xì)胞凋亡增多、心肌間質(zhì)纖維化等心肌重構(gòu)特征，為本研究提供了可靠的動(dòng)物模型。
　　(2) MS小鼠心肌重構(gòu)過(guò)程中ALDH2表達(dá)及活性均下降，ALDH2活性與心功能EF值呈明顯正相關(guān)。
　　(3)ALDH2可通過(guò)清除4-HNE，改善胰島素抵抗，起到保護(hù)MS小鼠心