乙醛脫氫酶2對高脂誘導的血管內(nèi)皮功能障礙的影響及其機制研究.pdf

1、論文Ⅰ
　　乙醛脫氫酶2對高脂誘導的血管內(nèi)皮功能障礙的影響及其機制研究
　　背景：
　　目前心血管疾病如冠心病、高血壓和糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為危害中國和世界人民健康的“頭號殺手”，如何提高心血管疾病的預防和診治水平已經(jīng)成為目前迫切需要解決的重大醫(yī)學和社會問題。這些疾病的共同病理學基礎都是血管病變，即血管功能障礙和結(jié)構(gòu)異常。然而目前對于血管內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)控、病變發(fā)生的分子機制以及干預靶點還不十分清

2、楚。
　　血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低、炎癥反應以及血管通透性增加等;胰島素抵抗是指機體的效應器官或組織對胰島素作用不敏感的一種病理生理現(xiàn)象，與冠心病、糖尿病和肥胖等許多代謝和心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，這些疾病在發(fā)生的早期均有不同程度的血管內(nèi)皮功能障礙和胰島素抵抗。通常胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙共同存在、相互促進。胰島素抵抗的患者一般會同時存在有胰島素誘導的血管舒張功能減弱。研究表明，在高糖、高脂、

3、炎癥因子、氧化應激等心血管致病因素刺激下，胰島素信號傳導通路受損，引起胰島素抵抗，胰島素通過IRS-PI3K-Akt信號通路刺激血管內(nèi)皮產(chǎn)生NO減少，導致血管內(nèi)皮功能障礙。
　　NLRP3炎癥小體是目前研究最多的一種炎癥小體。NLRP3屬于NOD樣受體(NLR)家族蛋白，它可以被高糖、高脂、炎癥因子、氧化應激等致病因素以及其他各種類型的分子、細菌和病毒所激活，然后與Caspase和ASC共同形成高分子量的蛋白復合體，即為“炎癥小體

4、”，從而活化Caspase-1，促進IL-1β前體分子的成熟和釋放，引起炎癥反應。目前對于NLRP3炎癥小體的激活和調(diào)控機制還不是很清楚。研究認為，活性氧物質(zhì)(ROS)可以激活NLRP3炎癥小體，ROS能夠使TXNIP與TRX解離，從而使TXNIP與NLRP3結(jié)合，進而激活NLRP3炎癥小體。最近，Zhou等人發(fā)現(xiàn)來源于線粒體的ROS對于NLRP3炎癥小體的激活具有非常關鍵的作用。NLRP3炎癥小體與許多疾病密切相關，最新研究表明它在動

5、脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，是二者共同的危險因素。
　　乙醛脫氫酶(ALDH2)是人體內(nèi)乙醇代謝的關鍵酶，主要存在于線粒體。除催化乙醇代謝產(chǎn)物乙醛氧化為乙酸外，它還可以將其他毒性醛類物質(zhì)如4-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE）氧化為無毒性的相應酸，具有一定的抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)ALDH2與心血管疾病密切相關，可以減輕心肌梗死、糖尿病以及飲酒等引起的心臟功能損傷、心肌細胞凋亡和線粒體功

6、能障礙等。目前我們課題組已經(jīng)證實糖尿病大鼠體內(nèi)ALDH2的活性明顯下降，其機制可能與氧化應激有關。許多研究包括2012年最新的全基因組序列分析已經(jīng)證實ALDH2是冠心病的易感基因。
　　基于以往的研究基礎，我們推論:1、NLRP3炎癥小體的激活在高脂誘導血管內(nèi)皮功能障礙的過程中具有重要作用;2、ALDH2可以通過胰島素信號通路改善高脂誘導的血管內(nèi)皮功能障礙，其機制可能是通過對NLRP3炎癥小體的調(diào)控。
　　目的：
　　

7、本課題的研究目的是探討:
　　1.NLRP3炎癥小體在高脂誘導血管內(nèi)皮功能障礙中的作用及機制。
　　2.ALDH2對高脂誘導的血管內(nèi)皮功能障礙的影響以及可能的機制。
　　3.ALDH2對NLRP3炎癥小體的調(diào)控及其機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):本實驗選用購自美國ATCC公司的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，培養(yǎng)基為含5％胎牛血清的ECM培養(yǎng)基。利用棕櫚酸(Palmiticacid, PA)加脂多糖

8、(LPS)刺激HUVECs誘導內(nèi)皮功能障礙。
　　2.動物模型:7周齡左右雄性C57BL/6J小鼠40只（體重20g左右），隨機分為4組，為對照+GFP病毒組、高脂+GFP病毒組、對照+ALDH2病毒組、高臘+ALDH2病毒組。對照組給予標準普通飼料飲食和高脂組給予含60％能量的高臘飲食(HFD)。10周后分別給予小鼠尾靜脈注射GFP慢病毒和ALDH2過表達慢病毒。12周后處死，留取小鼠主動脈血管等組織標本進行檢測。
　　3

9、.慢病毒轉(zhuǎn)染:各組HUVECs刺激前轉(zhuǎn)染GFP和ALDH2過表達慢病毒，轉(zhuǎn)染48小時后再給予LPS+PA刺激。
　　4.小干擾RNA轉(zhuǎn)染:HUVECs刺激前分組轉(zhuǎn)染人NLRP3、Caspase-1和ASC的小干擾RNA，干擾48小時后再給予LPS+PA刺激。
　　5.實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):收集各組HUVECs，提取RNA后進行RT-PCR，檢測各組細胞中ALDH2 mRNA的表達水平。
　　6.ALDH

10、2活性測定:提取細胞線粒體蛋白與ALDH2底物乙醛或丙醛反應，測定ALDH2的活性。
　　7.蛋白印跡法(Western blot，WB):各組刺激后收集HUVECs，提取蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度。分別檢測p-eNOS(Ser1177)、t-eNOS、p-Akt(Ser473)、t-Akt、p-AMPKα(Thr172)、 t-AMPKα、 NLRP3、 ASC、 Pro-Caspase-1、 cleavedCaspase-1(p10)

11、、Pro-IL-1β、IL-1β、ALDH2和β-actin等蛋白的表達水平。
　　8.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，使用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。p＜0.05認為是有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果：
　　1.PA顯著抑制IRS-1-Akt-eNOS信號通路的活性。
　　與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激可以降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達，但是總的Akt和e

12、NOS表達沒有改變;在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預刺激，可以更加顯著的降低Akt和eNOS的磷酸化表達。
　　2.NLRP3小體介導了PA對胰島素信號通路活性的損傷。
　　WB結(jié)果顯示:與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激沒有改變NLRP3炎癥小體、cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達，而在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預刺激，沒有改變NLRP3炎癥小體的表達，但是可以顯著

13、的增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達。不同濃度的IL-1β刺激可以顯著降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達，不改變Akt和eNOS總蛋白表達。利用siRNA抑制NLRP3炎癥小體表達后，IL-1β蛋白的表達明顯減少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達有了明顯的改善。
　　3.AMPKα負性調(diào)節(jié)PA對NLRP3炎癥小體的激活。
　

14、　與正常對照組和LPS組相比，單獨加不同濃度PA刺激可以降低p-AMPKα(Thr172)的表達而不改變總的AMPKα的表達，而在不同濃度PA刺激前提前加入LPS預刺激，可以更加顯著的降低p-AMPKα(Thr172)的表達。加入AMPK激活劑AICAR后，cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達明顯減少，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達有了明顯的改善。
　　4.增加ALD

15、H2的蛋白表達改善胰島素信號通路的活性。
　　HUVECs轉(zhuǎn)染ALDH2過表達慢病毒增加ALDH2蛋白表達后，p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達可以得到明顯改善。
　　5.增加ALDH2的蛋白表達可以通過激活AMPKα來抑制NLRP3炎癥小體的激活。
　　WB結(jié)果顯示:ALDH2過表達慢病毒可以使AMPKα磷酸化增加，cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β蛋白的表達明顯減少

16、
　　6.ALDH2可以明顯改善小鼠主動脈內(nèi)皮IRS-1-Akt-eNOS信號通路的活性。
　　小鼠體內(nèi)實驗顯示:與普通飲食相比，單獨ALDH2過表達沒有影響Akt和eNOS的磷酸化，HFD可以明顯降低p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表達，但是與HFD組相比，ALDH2過表達可以明顯恢復HFD引起的Akt和eNOS的磷酸化抑制。
　　7.在小鼠主動脈內(nèi)皮，ALDH2可以激活AMPK、抑制NL

17、RP3炎癥小體的激活。
　　小鼠主動脈內(nèi)皮的WB結(jié)果顯示:各組NLRP3炎癥小體的蛋白表達沒有改變。與普通飲食相比，單獨ALDH2過表達沒有改變p-AMPKα(Thr172)、cleavedCaspase-1(p10)和IL-1β的表達，HFD可以明顯抑制AMPKα的磷酸化、增加cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表達，但是與HFD組相比，HFD+ALDH2過表達可以明顯增加p-AMPKα(Thr172)的表

18、達、降低cleaved Caspase-1(p10)和IL-1β的表達。
　　結(jié)論：
　　1.高脂通過激活NLRP3炎癥小體損傷胰島素信號通路，進而引起血管內(nèi)皮功能障礙;
　　2.AMPKα介導了高脂對NLRP3炎癥小體的激活;
　　3.ALDH2可以通過增加胰島素信號通路的活性來改善高脂誘導的血管內(nèi)皮功能障礙，其機制可能與增加AMPKα的活性進而抑制NLRP3炎癥小體的激活有關。
　　論文Ⅱ
　　U

19、LK1在一氧化氦(NO)調(diào)節(jié)SIRT1表達中的作用及其機制研究
　　背景：
　　SIRT1是依賴于NAD+的第三類組蛋白去乙酰化酶，主要分布于細胞核，細胞質(zhì)內(nèi)也有。它廣泛存在于各種組織中，除組蛋白外，還作用于多種非組蛋白如p53、FOXO、eNOS、iNOS、NF-κB、PARP-1等，參與調(diào)控DNA修復、氧化應激、炎癥、糖脂代謝、細胞衰老等多種生理病理過程，對代謝綜合征、動脈粥樣硬化、糖尿病和衰老等多種心血管疾病具有重要作

20、用。健康的血管內(nèi)皮功能依賴內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。NO具有舒張血管活性，可以抑制動脈粥樣斑塊的聚集和促進血管新生。研究發(fā)現(xiàn)，eNOS生成NO需要SIRT1去乙酰化活性，SIRT1也可以保護炎癥和凋亡誘導的血管內(nèi)皮功能。
　　探討SIRT1的調(diào)控機制非常重要，它可以為這些疾病提供新的治療靶點。但是目前SIRT1蛋白調(diào)控的機制還不是很清楚。研究表明，eNOS可以正向調(diào)節(jié)SIRT1蛋白的表達。而且S

21、IRT1可以被p38蛋白激酶介導的蛋白酶體所降解，引起細胞衰老。最近研究證實eNOS產(chǎn)生的NO是26s蛋白酶體功能的內(nèi)源性抑制劑。
　　因此基于以上研究基礎，我們推測: NO可以通過抑制26s蛋白酶體活性來增加SIRT1蛋白表達。
　　目的：
　　本課題的研究目的是探討:NO對SIRT1蛋白表達的調(diào)控及其機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)、人胚胎腎臟上皮細胞系(HEK29

22、3T與HEK293AD)和GFPu-1細胞購自美國ATCC公司(Manassas，VA);表達GFP-LC3B的U20S細胞購自EMD Millipore（Billerica，MA）;小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)來源于Ulk1-/-，Ulk2-/-，Ulk1-/-/2-/-和WT小鼠。HUVECs培養(yǎng)基為含5％FBS的EBM培養(yǎng)基;MEF、HEK293T、U20S和GFPu-1細胞的培養(yǎng)基為含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。
　　2

23、.動物實驗:雄性eNOS敲除小鼠（10周齡）和db/db小鼠（25周齡）和相同周齡的C57BL/6JWT小鼠從Jackson lab購買。
　　3.腺病毒、質(zhì)粒和小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染:
　　腺病毒轉(zhuǎn)染:HUVECs和MEF細胞轉(zhuǎn)染eNOS和GFP對照的腺病毒48小時。
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:HEK293T細胞轉(zhuǎn)染UbG76V-GFP質(zhì)粒48小時。
　　siRNA轉(zhuǎn)染:HUVECs按照Santa Cruz公司提供

24、的方法轉(zhuǎn)染對照或者ULK1和β-TrCP1的siRNA48小時，
　　4.RT-PCR:使用總RNA提取試劑盒從HUVECs和HEK293T細胞提取總的RNA，然后用RT-PCR測定SIRT1和18s mRNA的水平。
　　5.26S蛋白酶體活性測定:使用含熒光的蛋白酶體底物AMC來測定糜蛋白酶樣活性來作為26蛋白酶體的活性，是ATP依賴的清除活性，具體是在37℃，380/460 nm波長條件下，用熒光酶標儀測定游離AMC的

25、水平。
　　6.糖基化修飾蛋白測定:用細胞裂解液提取細胞蛋白，用WGA方法測定糖基化修飾蛋白的表達水平。
　　7.蛋白印跡法(Western blot，WB):收集細胞后，提取蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度，測定ULK1、OGT、eNOS、SIRT1、O-GlcNAc、LC3B，、Beclin-1、p62、β-TrCP1、GFP、Rpt2、β7和β-actin蛋白的表達水平。
　　8.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，使用SPSS

26、軟件進行統(tǒng)計分析。p＜0.05認為是有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果：
　　1.在血管內(nèi)皮細胞中，NO穩(wěn)定和增加SIRT1的表達。
　　增加eNOS表達可以明顯的增加SIRT1的表達，eNOS的激動劑A23187和直接的一氧化氮NONOate可以增加SIRT1的表達，且具有時間依賴性，但是沒有改變SIRT1的mRNA表達水平。追逐實驗表明:不同時間點，CHX可以降低SIRT1蛋白表達，NONOate可以顯著的增加SIRT

27、1的穩(wěn)定性。另外，MG132作為一種26S蛋白酶體的抑制劑可以上調(diào)SIRT1的表達。
　　2.在血管內(nèi)皮細胞中，NO穩(wěn)定和增加ULK1的表達。
　　eNOS過表達可以明顯的增加ULK1的表達，不同的時間條件下，A23187和NONOate也可以增加ULK1的表達;同樣在追逐實驗中，NONOate和A23187都可以顯著的增加SIRT1的穩(wěn)定性。
　　3.ULK1介導了NO對SIRT1的調(diào)控。
　　在WT和Ulk2

28、-/-MEF細胞，eNOS過表達或者NONOate可以明顯的增加SIRT1的表達，但是在Ulk1-/-和Ulk1-/-/2-/-MEF細胞中SIRT1的表達沒有增加。在HUVECs中，與對照組相比，A23187和NONOate可以增加SIRT1蛋白的表達，用siRNA抑制ULK1表達以后，A23187和NONOate沒有增加SIRT1蛋白的表達。在HEK293T細胞中轉(zhuǎn)染ULK1質(zhì)粒后，SIRT1蛋白的表達明顯升高，但是mRNA水平?jīng)]有

29、改變。
　　4.NO或者ULK1對SIRT1的調(diào)控不依賴于自噬。
　　雷帕霉素可以激活LC3B和自噬小體，但是不能增加SIRT1的表達;NONOate對自噬小體的影響很小，而且NONOate、eNOS和A23187沒有改變自噬相關蛋白（p62、Beclin-1和LC3B）的表達;在MEF細胞中，自噬的抑制劑BafA1沒有恢復SIRT1的表達。
　　5.ULK1可以調(diào)控26S蛋白酶體的功能。
　　GFPu-1細胞（

30、檢測26S蛋白酶體活性的工具細胞）過表達ULK1后，GFP蛋白表達增加，GFP熒光增強，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后26S蛋白酶體活性降低;MEF細胞轉(zhuǎn)染UbG76V-GFP（一種26S蛋白酶體的檢測工具與GFPu-1相似）質(zhì)粒后，GFP表達明顯降低，Ulk1-/-MEF和siULK1轉(zhuǎn)染HUVECs都可以增加26S蛋白酶體活性。
　　6.OGT介導了ULK1對26S蛋白酶體的調(diào)控。
　　ULK1過表達顯著增加OGT蛋白表達

31、和糖基化修飾水平。使用WGA富集糖基化修飾蛋白，發(fā)現(xiàn)ULK1過表達可以增加Rpt2的糖基化。相反，使用siRNA抑制ULK1表達可以降低OGT蛋白表達和糖基化修飾水平，而且加入NONOate刺激后OGT蛋白表達和糖基化修飾水平不再增加。
　　7.在eNOS敲除小鼠和db/db小鼠組織可以驗證NO-ULK1-SIRT1通路。
　　eNOS敲除小鼠的肺臟組織中，ULK1和SIRT1蛋白表達明顯下降;在2型糖尿病db/db小鼠的肺