乙醛脫氫酶2在乙醇對內皮細胞保護中的作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　 大量流行病學資料表明，適量飲酒有保護心血管系統(tǒng)的作用，可降低冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，coronaryarterydisease，CAD）的發(fā)生率及病死率。早期研究多認為酒中的非乙醇活性成分起到了重要作用，后來研究發(fā)現乙醇對心血管系統(tǒng)起主要保護作用。實驗室研究發(fā)現，低劑量乙醇可通過激活腺苷受體依賴的PI3K-Akt通路增強臍靜脈內皮細胞內內皮型一氧化氮合酶(edothelialnitricoxidesynt

2、hase，eNOS)的表達及活性，并增加一氧化氮(nitricoxide，NO)生成及釋放。
　　 然而，乙醇作為一種外源性的小分子有機化合物，可通過自由擴散進入細胞內進行代謝，經由酒精代謝系統(tǒng)進行代謝時可伴隨產生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)?；钚匝鯇绕ぜ毎鹐NOS有雙面作用，并取決于ROS的水平。大量活性氧可通過eNOS脫偶聯或者拮抗其上游調節(jié)分子來抑制eNOS活性，導致內皮細胞功能紊亂;而少

3、量活性氧可以增強eNOS的活性。而在乙醇干預時的ROS水平取決于抗氧化體系的拮抗作用。
　　 近來研究發(fā)現，ALDH2不僅代謝乙醛，還可通過氧化丙二醛(malondialdehyde，MDA)和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）等毒性醛類物質來發(fā)揮間接抗氧化作用，拮抗ROS生成。多項研究結果表明調控ALDH2表達和活性可以影響機體細胞對氧化應激的應答。ALDH2活性可在轉錄、轉錄后調節(jié)與修飾、翻譯和翻

4、譯后修飾不同水平上進行調節(jié)。尤其是，ALDH2活性可受乙?；揎椀恼{控，其可被線粒體SIRT3直接脫乙?；鴮е旅富钚韵陆?。
　　 SIRT3具有依賴NAD+的組蛋白脫乙?；富钚?，位于線粒體基質中，可以通過調控線粒體蛋白乙酰化水平觸發(fā)一系列細胞適應性改變來應答代謝應激。SIRT3活性對細胞內NAD+/NADH比值變化十分敏感，呈正相關。有意思的是，乙醇代謝會導致NAD+/NADH比值下降，因此很有可能抑制SIRT3活性。

5、>　　 因此，我們提出以下假說:乙醇可通過增強ALDH2酶活性來調節(jié)細胞內ROS水平，進而影響乙醇增強eNOS活性的作用;且SIRT3依賴的乙酰化修飾作用可能參與乙醇對ALDH2活性的調控過程。依賴于SIRT3的ALDH2乙酰化修飾可能是乙醇保護作用的重要機制，是防治動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病的新靶點。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)與處理:培養(yǎng)人主動脈內皮細胞(humanaortice

6、ndothelialcells，HAECs)，使用內皮細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞生長融合至80-90％時，用不同濃度的乙醇刺激不同時間;用PI3K抑制劑或外源性NAD預處理細胞時，先用試劑預處理細胞24小時后，再用乙醇繼續(xù)孵育30分鐘;
　　 2.siRNA和質粒轉染:用特異性siRNA對細胞ALDH2和SIRT3進行抑制，用構建好的SIRT3過表達質粒提高細胞內SIRT3表達。首先用脂質體與siRNA/質粒形成復合物，后轉染入

7、HAECs。轉染后的細胞用/不用ROS清除劑預處理后，再加入乙醇繼續(xù)孵育;
　　 3.實時定量RT-PCR檢測:使用Trizol試劑提取細胞RNA，逆轉錄成cDNA后使用SYBRGreen進行實時定量RT-PCR?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-△△ct計算。
　　 4.Westernblotting檢測:使用細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用Westernblotting檢測方法從蛋白水平檢測用于檢測HAECs中ALDH2、eNO

8、S、p-eNOS、Akt、p-Akt、PI3K、SIRT3、4-HNE等蛋白的表達量。
　　 5.免疫共沉淀:用裂解液提取細胞總蛋白，加入抗體和蛋白A/G瓊脂糖吸附球共同孵育4℃過夜進行免疫沉淀，高速離心將瓊脂糖球去除并吸取上清液進行后續(xù)Westernblotting檢測。
　　 6.內皮細胞eNOS活性檢測:應用eNOS檢測試劑盒來分析細胞eNOS的活性，在激發(fā)波長495nm，發(fā)射波長515nm下進行吸光度測量。eNO

9、S相對活性用實驗組與對照組的活性比值來表示。
　　 7.線粒體ALDH2酶活性檢測:提取細胞線粒體，線粒體ALDH2活性是通過在酶標儀上監(jiān)測A340nm下NAD+轉化為NADH的含量變化所得。ALDH2酶活性單位為nmol/mg/min。
　　 8.線粒體SIRT3活性檢測:采用SIRT3活性熒光定量檢測試劑盒檢測，在激發(fā)光340nm和發(fā)射光440nm檢測熒光值。SIRT3相對活性是實驗組與對照組的活性比值來表示。

10、>　　 9.細胞內ROS水平檢測:應用DCFH-DA熒光探針對細胞內活性氧簇進行標記，后在流式細胞儀上進行檢測。
　　 10.線粒體NAD+/NADH比值檢測:細胞收集后提取線粒體，采用NAD+/NADH比值檢測試劑盒進行檢測，分別在450nm處讀取NADt和NADH數值。NAD+/NADH比值計算式為:[NADt-NADH]/NADH。
　　 結果：
　　 1.乙醇對內皮細胞eNOS活性的作用呈劑量依賴性:在

11、不同濃度乙醇處理細胞30min后，隨乙醇濃度增加，內皮細胞eNOS活性逐漸升高，在20mM乙醇作用下達到最高峰（1.67倍，P＜0.001），而后隨乙醇濃度增加eNOS活性逐漸下降，至100mM乙醇作用時回到基線水平。乙醇對eNOS活性調控呈時間依賴性:在乙醇作用5min后，內皮細胞eNOS活性即開始升高，在30min后達最大值，之后逐漸下降，且在乙醇作用120min后，內皮細胞eNOS活性仍然顯著高于對照組(P＜0.001);

12、　　 2.20mM乙醇作用30min后可使p-eNOS和p-Akt蛋白表達明顯增加，與乙醇對eNOS活性的作用趨勢一致，且乙醇的這一作用可被PI3K抑制劑拮抗，提示乙醇是通過激活PI3K/Akt通路提高內皮細胞eNOS活性的;
　　 3.ALDH2的活性在乙醇刺激下呈時間依賴性改變:乙醇處理后15min，內皮細胞ALDH2活性即開始明顯增加，并在30min達到最大值(1.65倍，P＜0.001)，但隨后即迅速下降，但對ALDH

13、2mRNA和蛋白表達沒有影響;
　　 4.ALDH2siRNA抑制內皮細胞ALDH2表達后，可拮抗乙醇增加Akt和eNOS活性的作用;
　　 5.20mM乙醇對細胞內ROS含量沒有影響。而在ALDH2siRNA預孵育的細胞中發(fā)現，乙醇干預細胞后ROS含量明顯升高66％。且ROS清除劑(NAC和DTT)可拮抗ALDH2siRNA對乙醇內皮保護的抑制作用;
　　 6.乙酰化ALDH2蛋白表達變化與乙醇刺激呈時間依賴性

14、。乙醇處理后15min，內皮細胞乙酰化ALDH2蛋白表達即開始明顯增加，并在30min達到峰值(P＜0.001)，但隨后即明顯下降，與ALDH2活性變化趨勢一致;
　　 7.20mM乙醇處理15min后SIRT3活性即下降，在30min時下降最為明顯，然后隨時間增加又逐漸恢復到基線水平。且過表達SIRT3可以抵抗乙醇上調ALDH2乙酰化和活性的作用;
　　 8.SIRT3過表達的內皮細胞受乙醇刺激后，ROS水平明顯增加。

15、且乙醇激活Akt和eNOS的作用也被SIRT3過表達質粒所抑制;
　　 9.乙醇處理內皮細胞15min后NAD+/NADH比值顯著下降，在30min時下降達最低值。外源性NAD干預下，乙醇抑制SIRT3活性的作用明顯減弱，且可抑制乙醇上調ALDH2和eNOS活性的作用。
　　 結論：
　　 1.乙醇通過激活PI3K-Akt通路提高eNOS活性;
　　 2.乙醇可上調ALDH2活性;
　　 3.AL