白血病細(xì)胞及其影響下內(nèi)皮細(xì)胞半乳凝素-9的表達(dá)特征研究.pdf

1、目的：急性白血病(AL)是常見(jiàn)的血液惡性腫瘤,雖經(jīng)化療及造血干細(xì)胞移植可使部分患者獲得完全緩解,但仍有部分患者復(fù)發(fā)難治,總體五年生存率很差。原因可能與AL細(xì)胞誘導(dǎo)形成免疫耐受相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)AL細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受可能通過(guò)以下途徑,下調(diào)MHC分子表達(dá),缺乏協(xié)同刺激分子不能有效激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答;分泌細(xì)胞因子抑制免疫反應(yīng);表達(dá)Fas配體誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡;DC細(xì)胞和NK細(xì)胞功能缺陷;以及Treg細(xì)胞增加。由此,AL細(xì)胞形成了一個(gè)免疫抑制性的微環(huán)

2、境。而其他細(xì)胞成分也能參與免疫抑制性微環(huán)境的形成,如內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞是AL微環(huán)境與外界相通的主要屏障,具有選擇通透性、產(chǎn)生細(xì)胞因子及參與淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮活動(dòng)等功能。最近研究發(fā)現(xiàn),半乳凝素-9(Gal-9)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能,其在誘導(dǎo)免疫耐受及腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用。Gal-9與Th1、Th17細(xì)胞及CTL細(xì)胞上的受體Tim-3結(jié)合,導(dǎo)致這些細(xì)胞凋亡;同時(shí)還能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)reg細(xì)胞,擴(kuò)增MDSC,進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫耐受。Gal

3、-9在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá),通過(guò)Gal-9/Tim-3誘導(dǎo)腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞凋亡而參與腫瘤免疫逃逸;并參與腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞及ECM的粘附而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。但目前無(wú)AL細(xì)胞以及其影響下內(nèi)皮細(xì)胞Gal-9表達(dá)的報(bào)道。因此,本研究擬對(duì)AL細(xì)胞及其影響下內(nèi)皮細(xì)胞Gal-9的表達(dá)特征進(jìn)行研究,以期為研究Gal-9/Tim-3途徑參與白血病免疫逃逸及轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用AL患者原代標(biāo)本進(jìn)行觀察,選擇符合條件的患者,取其骨髓或外

4、周血分離單核細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原代急性白血病細(xì)胞Gal-9表達(dá)情況,以非AL患者Gal-9表達(dá)為正常對(duì)照。檢測(cè)后讀取數(shù)據(jù),運(yùn)用CELLQuest軟件分析結(jié)果。取具有代表性的白血病細(xì)胞系,如急性髓系白血病細(xì)胞系(HL-60)、慢粒急性變白血病細(xì)胞(K562)、T細(xì)胞白血病細(xì)胞系(Jurkat),培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后檢測(cè)Gal-9的表達(dá)情況。以EAHY926細(xì)胞代表內(nèi)皮細(xì)胞,檢測(cè)Gal-9的表達(dá)及分布情況。并檢測(cè)白血病細(xì)胞影響下EAHY

5、926細(xì)胞Gal-9的表達(dá)情況。以HL-60細(xì)胞與K562細(xì)胞上清與EAHY926細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化及WesternBlot對(duì)Gal-9表達(dá)情況進(jìn)行半定量檢測(cè)。同時(shí)運(yùn)用相關(guān)軟件及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：AL患者骨髓及外周血原代白血病細(xì)胞表達(dá)Gal-9,表達(dá)水平為77.44±32.30(％),與正常對(duì)照組表達(dá)水平6.05±6.58(%)相比,原代急性白血病細(xì)胞高表達(dá)Gal-9,表

6、達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。已檢測(cè)的三種白血病細(xì)胞系(HL-60、K562、Jurkat)均能檢測(cè)到Gal-9的表達(dá),且表達(dá)水平較高。對(duì)EAHY926細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)Gal-9:92.67±2.33(%);細(xì)胞膜低表達(dá)Gal-9:0.25±0.11(%)。采用專業(yè)CCD拍攝免疫組化圖片,并用Image-ProPlus軟件分析免疫組化圖片。結(jié)果顯示,白血病細(xì)胞上清處理后EAHY926細(xì)胞Gal-9表達(dá)水平發(fā)生變化,其中

7、HL-60細(xì)胞上清組Gal-9表達(dá)下降明顯(P<0.05);而K562細(xì)胞上清組表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。同時(shí)WesternBlot結(jié)果顯示,經(jīng)HL-60細(xì)胞與K562細(xì)胞上清處理后EAHY926細(xì)胞Gal-9的表達(dá)水平均降低。
　　結(jié)論：與正常對(duì)照相比,急性白血病患者骨髓及外周血原代白血病細(xì)胞能高表達(dá)Gal-9。由于Gal-9與其天然受體Tim-3結(jié)合而導(dǎo)致Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞特異性CTL凋亡;因此,白血

8、病細(xì)胞可能通過(guò)Gal-9/Tim-3途徑參與免疫耐受及免疫逃逸。檢測(cè)的三種白血病細(xì)胞系均能檢測(cè)到Gal-9的高表達(dá),提示白血病細(xì)胞表達(dá)Gal-9具有普遍性。由于Gal-9參與腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞及ECM的粘附而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;且內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)Gal-9,而在白血病細(xì)胞影響下其表達(dá)水平降低;因此,白血病細(xì)胞可能通過(guò)降低內(nèi)皮細(xì)胞Gal-9表達(dá)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的目的。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討白血病細(xì)胞Gal-9/Tim-3途徑參與免疫耐受、