基于Allo-SCT后CMV感染特異性CD8+T細(xì)胞分離純化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)感染是同種異體干細(xì)胞移植術(shù)后主要的并發(fā)癥和死亡原因，健康志愿者的CMV特異性CD8+T細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療已用于該疾病的治療。保持提純后的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的功能對(duì)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用均有重要意義。運(yùn)用多聚體技術(shù)可以純化CMV特異性CD8+T細(xì)胞，但多聚體試劑可能改變CMV特異性CD8+T細(xì)胞的功能狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)過(guò)繼性免疫治療產(chǎn)生不利影響。鑒于上述原因，探討用于CMV特異性CD

2、8+T細(xì)胞提純的技術(shù)并檢測(cè)該技術(shù)對(duì)提純后的CD8+T細(xì)胞的功能影響至關(guān)重要。
　　方法：檢測(cè)30例HLA-A2/CMV血清陽(yáng)性的健康志愿者的血標(biāo)本，選擇其中CMV特異性CD8+T細(xì)胞含量較高的標(biāo)本用于提純實(shí)驗(yàn)。用多聚體技術(shù)（連鎖狀多聚體和四聚體）和MS磁柱技術(shù)從周?chē)獑魏思?xì)胞中提純CMV特異性CD8+T細(xì)胞。隨后，運(yùn)用多參數(shù)細(xì)胞免疫表型、CFSE增殖實(shí)驗(yàn)和ELISPOT分析檢測(cè)提純的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的功能，并和提純前CM

3、V特異性CD8+T細(xì)胞比較，了解多聚體技術(shù)對(duì)CMV特異性CD8+T細(xì)胞功能的影響。
　　結(jié)果：30例標(biāo)本中，CMV特異性CD8+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的百分率為0.15％～4.01％，其中16(53.3％)例超過(guò)0.5％。運(yùn)用連鎖狀多聚體技術(shù)和四聚體技術(shù)提純的CMV特異性CD8+T細(xì)胞具有相似的純度。提純后，CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純度增加30～50倍，最高達(dá)到96.79％，這些細(xì)胞表達(dá)CD8+CD45RA+CCR7-效應(yīng)T細(xì)

4、胞。培養(yǎng)8天后，分別有39.8％～45.5％經(jīng)過(guò)連鎖狀多聚體技術(shù)和四聚體技術(shù)純化的T細(xì)胞增殖。通過(guò)ELISPOT分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是連鎖狀多聚體或四聚體技術(shù)分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)同源CD8-抗原遞增細(xì)胞和CMVpp65抗原肽刺激后均分泌IFN-γ和粒酶B，而經(jīng)過(guò)連鎖狀多聚體技術(shù)分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞效能更高，兩種技術(shù)均可保持CMV特異性CD8+T細(xì)胞原有的細(xì)胞活性，其中，連鎖狀多聚體技術(shù)更具有優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)論