青蟹雙順反子病毒-1快速檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國東南沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖品種,但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,疾病不斷發(fā)生,導(dǎo)致青蟹養(yǎng)殖死亡率居高不下。青蟹雙順反子病毒-1(Mud crab dicistrovirus-1,學(xué)名Mud Crab virus)是從發(fā)生大規(guī)模死亡的青蟹中分離出來的、對擬穴青蟹存在很強的致病性的病原,對青蟹養(yǎng)殖危害嚴重?？焖佟蚀_、靈敏的檢測方法無論是對于該病的預(yù)防,還是對于該病的進一步深入研究都具有重要的

2、意義。因此,本文建立了該病毒的LAMP檢測方法、熒光定量PCR檢測方法、以及雙重巢式PCR檢測方法,并將這些檢測方法初步應(yīng)用于MCDV-1流行和感染特點研究。
　　首先,本研究以環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)為基礎(chǔ)建立了 MCDV-1的LAMP快速檢測方法。根據(jù)GenBank中MCDV-1 VP2基因序列,設(shè)計2對特異性引物,并優(yōu)化了反應(yīng)條件,確定了特異性和靈敏度。當外引物濃度為0.2μmol/L,內(nèi)引物濃度為1.6μmol/

3、L,Mg2+濃度為6mmol/L,dNTPs濃度為0.8 mmol/L,甜菜堿濃度為0.8mol/L,62℃反應(yīng)1h時,可獲得最佳檢測結(jié)果;通過渾濁度或加入SYBR Green I染色液,以肉眼觀察判定結(jié)果,或通過電泳結(jié)果判定。本方法可以特異性地擴增MCDV-1模板,而對鮑魚肌肉萎縮病毒(AbSV)、傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒(IHHNV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)、神經(jīng)壞死病毒(NNV)、

4、急性病毒性壞死癥病毒(AVNV)和青蟹呼腸孤病毒(MCRV)模板的檢測均為陰性。靈敏度試驗表明本方法可以檢測到低達6個拷貝的病毒基因,靈敏度較常規(guī)RT-PCR提高了至少1000倍。
　　其次,本研究根據(jù) MCDV-1基因序列,選擇高度保守區(qū)域設(shè)計引物和 TaqMan熒光探針,通過對實時定量PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化,建立了用于檢測青蟹雙順反子病毒-1的實時定量 PCR方法。利用該方法檢測 MCDV-1及鮑魚肌肉萎縮病毒(AbSV)、傳

5、染性表皮與造血組織壞死癥病毒(IHHNV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)、神經(jīng)壞死病毒(NNV)、急性病毒性壞死癥病毒(AVNV)和青蟹呼腸孤病毒(MCRV)這7種常見水生動物病毒,結(jié)果只能檢測到MCDV-1,表現(xiàn)了良好的特異性。該方法靈敏性高(可達8個拷貝的病毒基因)、重復(fù)性好(組內(nèi)及組間實驗的變異系數(shù)分別為1.11％以及1.3%)。建立的標準曲線在8.0×108～8.0 copies范圍內(nèi)存在很

6、好的線性關(guān)系(R2=0.992)。利用該方法對感染擬穴青蟹鰓組織不同部位 MCDV-1病毒量進行比較研究。結(jié)果顯示,擬穴青蟹鰓組織不同部位MCDV-1的量在1010-1011copies/g之間。不論左、右部鰓絲、上、中、下部鰓絲,或鰓絲的頂部、中部和基部,所攜帶的病毒量并不存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。即MCDV-1在感染擬穴青蟹鰓組織后,均勻分布于鰓組織的各個部位。
　　此外,本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守區(qū)設(shè)計4對引物,建立

7、了可同時檢測這兩種病毒的雙重巢式PCR(duplex-nested PCR)檢測方法。PCR產(chǎn)物因大小不同而得以區(qū)分。研究發(fā)現(xiàn)該方法對兩種病毒的檢測限都可以達到10個拷貝,并且與鮑魚肌肉萎縮病毒(AbSV)、傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒(IHHNV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)、神經(jīng)壞死病毒(NNV)、急性病毒性壞死癥病毒(AVNV)這6種水生動物常見病毒均無交叉反應(yīng),可以特異性地檢測兩種病毒。

8、運用該方法對陽江地區(qū)2012年5-10月捕撈的野生擬穴青蟹病毒攜帶情況進行調(diào)查,結(jié)果顯示,陽江地區(qū)2012年5-10月的野生青蟹體內(nèi)一直保持著較高的病毒攜帶率(44.83-100%)。MCDV-1檢出率最高的月份為6、8、9月,MCRV檢出率最高的月份為5-6月和8-9月。故而,兩種病毒的流行月份為5-6月和8-9月,流行期間野生擬穴青蟹體混合感染的比例在10-100%之間。
　　總之,本研究建立的MCDV-1快速檢測方法特異、敏