阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7表達(dá)KIF4A的抑制作用.pdf

1、目的：
　　 KIF4是KIFs家族中一員，是一類以氨基末端為驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)域的驅(qū)動(dòng)蛋白。阿霉素是治療乳腺癌常用的有效化療藥物之一。低劑量的阿霉素常常誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，這有助于降低藥物的多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象。探討KIF4A在阿霉素處理的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7表達(dá)的變化，有助于進(jìn)一步闡明KIF4A的功能及其與阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤衰老的關(guān)系。
　　 方法：
　　 接種MCF-7細(xì)胞于培養(yǎng)皿，次日用1μmol·L-1的阿霉素處

2、理細(xì)胞2小時(shí)，對(duì)照不處理，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別于阿霉素處理后第12、24、48、72、96小時(shí)，用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞收集蛋白，用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度，取等量（25μg）蛋白進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。用抗KIF4A抗體檢測(cè)KIF4A，用β-微管蛋白作為上樣對(duì)照（loadingcotrol）。將Western blowing的結(jié)果用Image-Pro Plus6.0軟

3、件進(jìn)行光密度分析，之后將各蛋白條帶的光密度值用于下列公式計(jì)算KIF4A蛋白表達(dá)抑制率：KIF4A蛋白表達(dá)抑制率（％）=100％x[（未處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）-（處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）]/（未處理組KIF4A蛋白/β-微管蛋白）。
　　 接種MCF-7細(xì)胞于培養(yǎng)皿，次日分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1的阿霉素處理細(xì)胞2小時(shí)，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)

4、培養(yǎng)細(xì)胞。于阿霉素處理后第96小時(shí)取出培養(yǎng)皿，收集蛋白，行蛋白濃度測(cè)定，取等量蛋白行Western blot檢測(cè)。用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行光密度分析，并且計(jì)算KIF4A蛋白表達(dá)抑制率。
　　 用PCR擴(kuò)增KIF4A基因完整開(kāi)放讀碼框架（ORF），并將其與pEGFP-C1連接，形成KIF4A的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-KIF4A。在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將pEGFP-KIF4A和作為對(duì)照的pEGFP-C1質(zhì)粒用Lip

5、ofectaminTM轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中。20-24小時(shí)后，用阿霉素處理，而后置于熒光顯微鏡下觀察KIF4A的表達(dá)及分布。
　　 接種適量的MCF-7細(xì)胞于培養(yǎng)皿，次日用1μmol·L-1的阿霉素處理細(xì)胞2小時(shí)，對(duì)照不處理，后換以10％胎牛血清的DMEM于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。于阿霉素處理后第96小時(shí)，取出培養(yǎng)皿，行衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色，次日于倒置顯微鏡下觀察衰老細(xì)胞，計(jì)算衰老染色率（染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總細(xì)胞

6、數(shù)）。
　　 結(jié)果：
　　 阿霉素處理后不同時(shí)間段收集蛋白行Western blot檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在處理后第12、24和48h，阿霉素雖可抑制KIF4A蛋白表達(dá)，但其抑制作用并不十分明顯，KIF4A蛋白與β-微管蛋白光密度比值分析顯示，其表達(dá)的抑制率僅介于20％～35％之間；而在72和96h，阿霉素處理的MCF-7細(xì)胞表達(dá)KIF4A顯著降低，其表達(dá)的抑制率均高達(dá)65％以上，其中，尤以96h最明顯。
　　 用不

7、同濃度的阿霉素處理MCF-7細(xì)胞，96h后收集蛋白行 Western blot檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，雖然0.1μmol·L-1以下濃度的阿霉素對(duì)KIF4A蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但0.5μmol·L-1及以上濃度的阿霉素均可顯著降低KIF4A蛋白水平，KIF4A蛋白與β-微管蛋白光密度比值分析顯示其表達(dá)的抑制率均高達(dá)50％以上，并且呈濃度依賴性。
　　 pEGFP-KIF4A質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞高表達(dá)KIF4A，鏡下觀

8、察帶有綠色熒光的KIF4A蛋白主要分布在細(xì)胞核，呈圓形或橢圓形，核仁未見(jiàn)分布。用阿霉素處理之后，其分布未見(jiàn)改變。
　　 與未用阿霉素處理的MCF-7細(xì)胞相比，用1μmol·L-1的阿霉素處理2小時(shí)的MCF-7細(xì)胞的衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色率由5％提高到42％，細(xì)胞核周邊出現(xiàn)藍(lán)染區(qū)域，細(xì)胞呈衰老樣變：體積變大，扁平，胞漿顆粒增多，富含液泡。
　　 結(jié)論：
　　 阿霉素處理MCF-7細(xì)胞可使KIF4A蛋白表達(dá)水平降低，