腹腔氣霧化療減少裸鼠腹膜癌種植的實驗研究.pdf

1、胃腸道惡性腫瘤是我國發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤，目前治療主要以手術(shù)為主，但術(shù)后仍有約50％左右患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，成為影響長期生存的直接因素。腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞(free cancer cell，F(xiàn)CC)和不能完全手術(shù)切除的微小癌灶的存在是造成腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因之一。怎樣清除術(shù)后腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞和腹腔內(nèi)的微小癌灶已成為降低進(jìn)展期胃腸道癌術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)率，提高胃腸道腫瘤術(shù)后遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵。國內(nèi)外學(xué)者為探索胃腸癌的綜合治療方法進(jìn)行了

2、不懈努力，包括術(shù)前的動脈灌注化療、術(shù)中腸腔內(nèi)化療、術(shù)前放療化療結(jié)合、圍手術(shù)期的輔助化療等，但對腹腔種植的療效均不令人滿意。近年來，腹腔內(nèi)區(qū)域性化療因其獨特的藥代動力學(xué)特征及其他基礎(chǔ)特點而備受重視。研究表明，腹腔化療具有藥代動力學(xué)優(yōu)勢，可以有效的預(yù)防和治療胃結(jié)腸癌術(shù)后腹膜及肝臟的復(fù)發(fā)?？鼓[瘤作用的強弱與腫瘤瘤灶周圍的抗腫瘤藥物的濃度成正比，腹腔內(nèi)給藥后其代謝途徑主要是經(jīng)門靜脈循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，由肝臟代謝成低毒形式，只有很少一部分通過腹膜廓

3、清直接進(jìn)入體循環(huán)，與靜脈化療全身廓清相比，由于“腹腔-血漿屏障”作用，腹腔內(nèi)化療藥物濃度可以為血管內(nèi)給藥濃度的數(shù)倍乃至數(shù)十倍，在腹腔內(nèi)提供了恒定持久高濃度的抗癌藥，使腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞和微小癌灶直接浸泡在高濃度的抗癌藥液中，從而大大加強了抗腫瘤藥物的作用。自Jacob等最早報道了應(yīng)用腹腔鏡行結(jié)直腸手術(shù)，1994年日本的Kitano等首次報道了腹腔鏡胃癌手術(shù)以來，由于術(shù)后疼痛輕、胃腸功能恢復(fù)快及對機體免疫功能影響小等微創(chuàng)優(yōu)點明顯，腹腔鏡技術(shù)

4、在胃腸外科逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。但是腹腔鏡手術(shù)需要建立氣腹以顯露術(shù)野，術(shù)中氣腹的影響可能使FCC播散種植的危險增大，氣腹的渦流作用可能將腹腔脫落的癌細(xì)胞播散開來，從而造成腹膜種植轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響治療效果。如何有效殺滅這些脫落的腹腔游離癌細(xì)胞已成為困撓腹腔鏡胃腸道腫瘤外科的難題。在腹腔鏡胃腸腫瘤手術(shù)過程中，能否利用氣腹這一技術(shù)特點，將抗癌藥物霧化后隨氣腹導(dǎo)入腹腔，達(dá)到抑制FCC種植的效果?為回答這一問題，本實驗采用人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞裸鼠種

5、植模型，實施5-FU氣霧化療，初步觀察其療效。 目的 1、研制可與人工氣腹機相連接的氣霧化療儀，該儀器可控制單位時間內(nèi)注入化療藥物的量，并且不改變化療藥物的化學(xué)性質(zhì)。 2、觀察5-FU腹腔氣霧化療對裸鼠腹腔游離癌細(xì)胞腹膜種植的影響。 方法 1、氣霧化療儀的研制與第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院器材科工程師合作，共同研制可與人工氣腹機相連接的氣霧化療儀，根據(jù)擬采用化療藥物(5-氟尿嘧啶)的分子量，調(diào)整超聲波頻率

6、，在不破壞藥物化學(xué)性質(zhì)的情況下，將化療藥物隨CO<,2>氣腹建立的同時霧化成氣體注入裸鼠腹腔，并控制單位時間內(nèi)注入化療藥物的量。 2、實驗動物及分組Balb/C(nu/nu)裸小鼠由第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物中心提供，4～6周齡，體重17～20g，共60只，雌雄兼有。實驗裸鼠及實驗條件達(dá)到無特殊病原菌(specific-pathogen-free，SPF)級標(biāo)準(zhǔn)。將實驗裸鼠隨機分為二組：腹腔氣霧化療組和對照組。每組各30只。

7、 3、人結(jié)腸癌(LoVo)細(xì)胞株細(xì)胞懸液配制人結(jié)腸癌(LoVo)細(xì)胞在37℃，培養(yǎng)液為含10％熱滅活小牛血清、青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，5％CO<,2>飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，48h換液一次。體外培養(yǎng)的細(xì)胞處于對數(shù)生長期生長密集時，用2.5g/L胰蛋白酶消化1～2min，傾出消化液，加入無血清RPMll640洗滌，用機械吹打法取出細(xì)胞，2000r/min離心10min，用無血清RPMI1

8、640配成1×10<'10>/L接種細(xì)胞濃度，用相差顯微鏡觀察呈均勻的單細(xì)胞懸液，以苔盼藍(lán)(trypan blue)染色檢測細(xì)胞活力>99％。 4、人結(jié)腸癌LOVo細(xì)胞裸鼠腹腔種植模型的制備用75％的酒精消毒裸鼠腹部皮膚，取1mL注射器，4.5號針頭抽吸已制備的細(xì)胞懸液0.5mL(含5×10<'6>瘤細(xì)胞)，于右下腹穿刺入腹，緩慢注入后迅速拔針，用酒精棉球稍按壓進(jìn)針處皮膚。 5、腹腔氣霧化療無菌條件下，腹腔內(nèi)注射1％戊巴

9、比妥鈉(用藥量0.05mg/g體重)麻醉裸鼠，固定于特制的鼠臺上。麻醉成功后，使用自制氣腹裝置于裸鼠左上腹穿刺7號氣腹針模擬腹腔鏡手術(shù)建立人工氣腹，觀察腹壁均勻膨隆后，右下腹插入一根4號穿刺針模擬腹腔鏡穿刺trocar，用來調(diào)整出口氣體流速，維持氣腹壓約8mmHg，氣霧化療儀與氣腹機管道相連通，同時進(jìn)行氣霧化療。氣霧化療組：將氟尿嘧啶(20mg/kg)用生理鹽水稀釋成20ml，隨CO<,2>氣體同時進(jìn)入腹腔。對照組：生理鹽水20ml，隨

10、CO<,2>氣體同時進(jìn)入腹腔。灌注時間均為30min，在霧化過程中注意調(diào)整出入管通暢，灌注結(jié)束后盡量使腹腔內(nèi)的氣體排凈、液體流出。 6、觀察指標(biāo)：①致瘤率。②體重變化。⑧有無腹水。④病理學(xué)檢查：把處死的裸鼠解剖，將肉眼觀察可疑及明確出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的肝臟、脾臟、腹膜等組織采集，10％甲醛固定，石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅染色(HE)染色，光鏡觀察。 7、統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包分析，計量資料以x±s表示，兩組均數(shù)

11、比較采用t檢驗，體重變化作重復(fù)測量方差分析，計數(shù)資料采用列聯(lián)表X<'2>檢驗，P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果 1、致瘤率：氣霧化療組為36.7％(11/30)，對照組為100％(30/30)。兩組相比，X<'2>=27.805，P=0.000，差異有顯著性意義。 2、體重變化：開始實驗時及實驗后第2周稱重時，實驗組小鼠體重與對照組小鼠相比無顯著性差異。此后對照組小鼠體重增長速度較實驗組顯著增加，實驗后第4周時

12、實驗組小鼠體重顯著低于對照組小鼠體重(P=0.013)，至第6周稱重時二組小鼠體重比較仍有顯著性差異(P=0.000)。3、腹水情況：實驗6周時部分裸鼠明顯可見有腹水。打開腹腔，兩組中致瘤裸鼠腹腔內(nèi)均可見不等量血性腹水(約2-5ml)。出現(xiàn)腹水的時間早晚和腹水的量多少相對應(yīng)。 4、病理結(jié)果：腫瘤結(jié)節(jié)主要分散生長于腸道漿膜面，腹壁上，大小不等，質(zhì)較硬，灰白色，剖面呈魚肉樣，部分較大瘤體中央出現(xiàn)壞死區(qū)。部分實驗鼠在腹膜、腸系膜、腸系