腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）基因克隆及其基因工程細(xì)胞對體外培養(yǎng)腦片生長的影響.pdf

1、目的：帕金森氏病(PD)是神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系常見的慢性退行性疾病。主要病理變化是位于中腦黑質(zhì)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性和消失，導(dǎo)致紋狀體的DA能神經(jīng)纖維終末變性消失，這種黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)傳導(dǎo)路的損害使得DA水平下降，由此產(chǎn)生了PD的典型癥狀。目前，臨床上對PD治療的研究主要集中在兩個方面：一是以補(bǔ)充多巴胺的不足為目的藥物治療：如給病人定期服用左旋多巴，美多巴，息寧，安坦等，通過藥物治療病人的大多數(shù)臨床癥狀改善，但并不能阻止病情的發(fā)展，即

2、不能治愈。另一種方法是以搶救幸存神經(jīng)元為目的的治療：如導(dǎo)入神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)作為神經(jīng)生長因子家族成員，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著密切關(guān)系，不僅對中樞神經(jīng)元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對損傷后神經(jīng)元的修復(fù)與功能重塑也起了重要作用。近年來神經(jīng)生長因子家族一些成員紛紛被克隆并應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的防治。 針對上述研究

3、趨勢，本研究采用腦皮質(zhì)-紋狀體-黑質(zhì)三組織聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)，選用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)通過RT-PCR及載體克隆的方法，構(gòu)建BDNF真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BDNF，以重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BDNF作為外源性基因，與脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，通過熒光顯微鏡觀察，并結(jié)合BDNF免疫細(xì)胞化學(xué)染色等形態(tài)學(xué)方法鑒定穩(wěn)定表達(dá)BDNF蛋白的基因工程細(xì)胞，檢測其對體外聯(lián)合培養(yǎng)腦片生長的影響。 材料與方法：(一)

4、大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化研·1·究1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的采集與貼壁法培養(yǎng)。 2.反復(fù)傳代，使BMSCs得到擴(kuò)增和純化，獲得高純度的BMSCs。 3.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定：應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記：CD34、CD71。 4.誘導(dǎo)液的制備：收集腦片培養(yǎng)液。 5.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化及鑒定：Nissel染色、NSE和GFAP及TrkB免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

5、 (二)BDNF熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)1.大鼠胚胎腦組織總RNA提取。 2.RT-PCR擴(kuò)增BDNF基因片段。 3.測序載體PMD-18-T-BDNF構(gòu)建、鑒定。 4.真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BDNF構(gòu)建、鑒定、測序。 5.轉(zhuǎn)染到從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)的BMSCs中。 6.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的觀察及BDNF免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。 (三)轉(zhuǎn)染BDNF基因的骨髓基質(zhì)

6、干細(xì)胞對中腦黑質(zhì)-紋狀體腦片生長的影響 1.大腦皮質(zhì)-中腦黑質(zhì)-紋狀體腦片培養(yǎng)。 2.熒光顯微鏡下神經(jīng)元存活率的檢測。 3.TH免疫組織化學(xué)染色。 4.黑質(zhì)腦片的TH陽性神經(jīng)細(xì)胞和紋狀體中TH陽性神經(jīng)纖維密度及含量測定。 結(jié)果：(一)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化研究L分離的圓形骨髓單個核細(xì)胞于12h貼壁生長；培養(yǎng)15天的細(xì)胞作活體甲苯胺蘭染色，可見細(xì)胞長成漩渦狀。2.對培養(yǎng)第6代的

7、細(xì)胞作免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，結(jié)果CD71呈現(xiàn)棕色，即為陽性，CD34呈現(xiàn)陰性。這證明培養(yǎng)的細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的亞群。3.經(jīng)過用腦片培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，細(xì)長形細(xì)胞中有Nissel染色反應(yīng)產(chǎn)物。4.誘導(dǎo)后的60％細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及酪氨酸激2酶受體B(TrkB)，未見神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。 (二)BDNF熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs18h后，在倒置熒光顯微鏡下，p

8、EGFP-N1-BDNF和pEGFP-N1空載體組鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見熒光。GFP呈陽性的BMSCs細(xì)胞數(shù)約為60％。 2.通過BDNF蛋白的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法，鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞呈綠色熒光反應(yīng)，陽性的BMSCs細(xì)胞數(shù)約為50％，提示BDNF在細(xì)胞中表達(dá)，未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSCs成陰性反應(yīng)。 (三)轉(zhuǎn)染BDNF基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對中腦黑質(zhì)-紋狀體腦片生長的影響1.實驗組較對照組的腦片長

9、勢更旺盛，生長暈較寬。中腦黑質(zhì)中有長的突起長入紋狀體內(nèi)，且有很強(qiáng)的趨化性。大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞也向周圍伸出突起，但無明顯的方向感。 2.經(jīng)過TH免疫組織染色，證明由中腦黑質(zhì)長人紋狀體中的神經(jīng)纖維為TH陽性。實驗組Ⅱ和實驗組Ⅰ中的紋狀體中TH陽性神經(jīng)纖維密度在第20d和30d時，顯著高于對照組(p＜0.05)，實驗組Ⅱ在30d時極顯著高于對照組(p＜0.01)。實驗組Ⅱ與實驗組Ⅰ差異不顯著。 3.10d、20d和30d時，培

10、養(yǎng)腦片溴化乙啶染色結(jié)果為，實驗組未發(fā)現(xiàn)熒光。對照組在20d時，約有10％的細(xì)胞死亡，在30d時培養(yǎng)的腦片中大面積的細(xì)胞呈現(xiàn)熒光反應(yīng)即為死細(xì)胞。 結(jié)論：1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能在腦片培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元并表達(dá)神經(jīng)元的特異性標(biāo)記蛋白酶-NSE及細(xì)胞中有尼氏體出現(xiàn)，培養(yǎng)液中的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族激活TrkB信號傳導(dǎo)通路可能是BMSCs定向誘導(dǎo)分化的機(jī)制之一。 2.本實驗通過基因重組的方法將BDNF基因克隆到質(zhì)粒pEGFP-N1上

11、，采用菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列分析的方法鑒定BDNF熒光真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將pEGFP-N1-BDNF轉(zhuǎn)入BMSCs，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測到轉(zhuǎn)染后的BMSCs中有BDNF蛋白的表達(dá)，獲得了可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子又有熒光生物學(xué)標(biāo)記·3·物特征的工程型細(xì)胞材料。 3.Milliercell膜上大腦、紋狀體及黑質(zhì)聯(lián)合腦片培養(yǎng)是一種簡便有效的神經(jīng)組織體外培養(yǎng)方法，可用于制作帕金森病等的組