失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞mtDNA COXⅠ基因損傷及Rg1對(duì)mtDNA表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的影響.pdf

1、失血性休克可導(dǎo)致機(jī)體各組織器官損傷，其中腸道是最容易受損傷的主要靶器官。失血性休克后腸粘膜上皮細(xì)胞缺血缺氧，能量代謝障礙是不可逆性休克和多器官功能衰竭的重要原因。線粒體是能量轉(zhuǎn)換的細(xì)胞器，在維持細(xì)胞正常的能量代謝、結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用。線粒體氧化磷酸化過程由mtDNA(mitochondrialDNA，mtDNA)和nDNA(nuclearDNA，nDNA)共同編碼的5個(gè)酶復(fù)合體組成的呼吸鏈完成。mtDNA編碼13條多肽,mtDN

2、A功能是相對(duì)獨(dú)立的，但nDNA在其復(fù)制、表達(dá)及線粒體蛋白質(zhì)組裝等方面均起著重要的作用。nDNA和mtDNA在轉(zhuǎn)錄水平也是協(xié)同表達(dá)的，其協(xié)同表達(dá)需要一定的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制因子，這些核調(diào)控因子在控制核一線粒體相互作用中發(fā)揮重要作用，也對(duì)mtDNA復(fù)制表達(dá)起著調(diào)控作用。 基因表達(dá)調(diào)控是在多級(jí)水平上進(jìn)行的復(fù)雜事件。線粒體基因組與核基因組在遺傳信息表達(dá)上關(guān)系密切，基因的缺失和突變可能導(dǎo)致核質(zhì)基因不協(xié)調(diào)，使能量代謝效率降低。在嚴(yán)重創(chuàng)傷、失血性休克

3、等病理?xiàng)l件下，調(diào)控線粒體基因表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活因子1(peroxisomeprolifemtor-activatedreceptorYcoactivator-1，PGC-1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mitochondrialtranscriptionfactorA,mtTFA)和核呼吸因子(nuclearrespiratorytranscriptionfactors,NRFs)等基因的表達(dá)變化規(guī)律，國內(nèi)外文獻(xiàn)

4、尚缺乏相關(guān)報(bào)道。mtDNA編碼基因mRNA的改變是線粒體受損傷后功能下降引起的還是核編碼調(diào)控因子表達(dá)的改變引起的，在休克缺血缺氧時(shí)核編碼調(diào)控因子表達(dá)的改變對(duì)mtDNA編碼基因mRNA表達(dá)有無影響或影響程度如何，都需要加以闡明。 已知三七皂甙單體Rg1可通過對(duì)線粒體的形態(tài)功能、COX活性和基因表達(dá)多方面的調(diào)節(jié)作用，而保護(hù)線粒體。但Rg1是如何上調(diào)COX基因表達(dá)，在細(xì)胞核對(duì)線粒體基因調(diào)控的過程中發(fā)揮了什么作用還未闡明。研究失血性休克

5、時(shí)Rg1對(duì)PGC-1，mtTFA,NRF-1，等基因表達(dá)的影響，探討Rg1對(duì)PGC-1、mtTFA和NRF-1等基因表達(dá)的作用，從而可在基因調(diào)控水平探討Rg1對(duì)失血性休克動(dòng)物的保護(hù)機(jī)理，為Rg1治療失血性休克提供充分的理論的依據(jù)。 目的： 1.研究失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞mtDNACOXI基因的損傷，及對(duì)其編碼蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的影響，闡明失血性休克與細(xì)胞COXI基因損傷的關(guān)系。 2.研究失血性休克大鼠缺血缺氧腸上皮

6、細(xì)胞調(diào)控線粒體基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子PGC-1、mtTFA、NRF-1等基因表達(dá)的改變，研究核編碼線粒體蛋白COXIV、線粒體編碼線粒體蛋白COXI基因表達(dá)的改變。探討失血性休克時(shí)這些核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)COXⅣ和COXI基因表達(dá)及線粒體功能的影響，揭示核基因和線粒體基因在失血性休克細(xì)胞線粒體能量代謝障礙中的作用。 3.研究Rg1對(duì)失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1、mtTFA、NRF-1及COxIV、COXⅠ等基因表達(dá)的影響，探討Rg1

7、在PGC-1、mtTFA、NRF-1等基因表達(dá)過程中的作用，從而在基因調(diào)控水平探討Rg1對(duì)核及線粒體基因表達(dá)及失血生休克動(dòng)物的保護(hù)效應(yīng)，探索其保護(hù)機(jī)理。 方法： Wistar大鼠120只，按改良Wigger’s法制作失血性休克模型，動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、失血性休克組、治療組，其中治療組又分為單純復(fù)蘇對(duì)照組，復(fù)蘇加Rg1治療組，復(fù)蘇加SB202190組，復(fù)蘇加茴香霉素組，復(fù)蘇加Rg1加SB202190組，復(fù)蘇加Rg1加茴香霉

8、素組。于失血性休克后不同時(shí)相分離腸上皮細(xì)胞及其線粒體，提取mtDNA、細(xì)胞總蛋白、總RNA及制備電鏡標(biāo)本，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞mtDNACOXI基因損傷，并利用計(jì)算機(jī)同源模建的方法進(jìn)行腸上皮細(xì)胞mtDNACOXI基因突變位點(diǎn)與其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及其對(duì)功能的影響；采用RT-PCR法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞核基因PGC-1、mtTFA、NRF-1、COXⅣ及mtDNACOXImRNA的莉達(dá)變化；采用Westem-blot法檢測(cè)腸

9、上皮細(xì)胞PGC-1蛋白的表達(dá)變化；采用紫外分光光度法檢測(cè)COX活性；采用熒光分光光度法檢測(cè)線粒體膜電位。從失血性休克大鼠核轉(zhuǎn)錄因子及其輔激活因子的表達(dá)、編碼線粒體蛋白基因表達(dá)、線粒體COX活性、線粒體膜電位等多方面研究失血生休克時(shí)線粒體基因和核基因損傷及其核轉(zhuǎn)錄因子在其中起的作用，并探討三七皂甙單體Rg1對(duì)缺血缺氧性細(xì)胞及其線粒體損傷的保護(hù)作用。 結(jié)果： 1.失血性休克5h可導(dǎo)致大鼠腸上皮細(xì)胞mtDNACOXI基因從55

10、45到6838位點(diǎn)出現(xiàn)了31個(gè)散在性點(diǎn)突變，其中大部分導(dǎo)致了編碼氨基酸的改變從而使突變區(qū)的30-32肽段結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。 2。失血性休克1h大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1mRNA表達(dá)增加，失血性休克3h后又開始減弱，休克晚期PGC-1mRNA表達(dá)顯著減弱；失血性休克2hPGC-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，后又減弱，失血f生休克5h已明顯弱于休克前。復(fù)蘇加Rg1可上調(diào)輔激活因子PGC-1mRNA及其蛋白表達(dá)。Rg1在SB202190存在時(shí)，不能

11、上調(diào)PGC-1mRNA及其蛋白表達(dá)，但Rg1和茴香霉素同時(shí)作用時(shí)PGC-1mRNA及其蛋白明顯增強(qiáng)。 3.失血性休克早期NRF1和mtTFAmRNA表達(dá)變化不明顯，至休克3，4h分別有所增強(qiáng)，到休克5h均下降到休克前水平。Rg1不能上調(diào)NRF-1和mtTFAmRNA表達(dá)，但Rg1與茴香霉素一起作用時(shí)上調(diào)mtTFA和NRF-1mRNA表達(dá)。 4.失血性休克1h大鼠腸上皮細(xì)胞COXImRNA表達(dá)開始增加，3h達(dá)高峰，后又降低

12、，到休克5h顯著低于休克前水平。失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞核基因編碼COXⅣmRNA休克3h略有增高，休克4h后開始下降，至休克晚期低于休克前水平。復(fù)蘇加Rg1能增強(qiáng)COXI、COXⅣmRNA表達(dá)，復(fù)蘇加Rg1與SB202190或茴香霉素一起作用時(shí)均能上調(diào)COXI、COXⅣmRNA表達(dá)。 結(jié)論及討論： 1.失血性休克晚期可導(dǎo)致大鼠腸上皮細(xì)胞mtDNACOXI基因突變；COXI基因突變后，因使其編碼氨基酸發(fā)生改變而使突變區(qū)3

13、0-32肽段結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，從而改變了附近的電荷性質(zhì)、親疏水性質(zhì)和空間特性，直接影響了全酶復(fù)合物的形成，減弱了COX的活性。 2.失血性休克大鼠腸上皮細(xì)胞PGC-1mRNA表達(dá)先增強(qiáng)后減弱，NRF1和mtTFAmRNA表達(dá)變化不明顯，說明PGC-1對(duì)缺血缺氧比較敏感，休克晚期PGC-1表達(dá)顯著降低，對(duì)線粒體和細(xì)胞核基因組均有一定影響；而且失血性休克時(shí)PGC-1和NRF-1及mtTFA的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)并不一致，NRF-1及mt

14、TFAmRNA表達(dá)變化有一個(gè)相對(duì)滯后的過程。NRF-1及mtTFAmRNA表達(dá)變化在休克時(shí)發(fā)生較晚，且升高幅度較小，說明休克時(shí)核基因調(diào)控能力下降，也是線粒體基因表達(dá)下降的重要原因。 3.失血性休克早期PGC-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，晚期減弱，說明缺血缺氧早期可上調(diào)PGC-1蛋白表達(dá)，可能與PGC-1mRNA的上調(diào)有關(guān)。 4.失血性休克中期大鼠腸上皮細(xì)胞核基因編碼COXIVmRNA略有增高，至休克晚期低于休克前水平，相對(duì)于線粒體編

15、碼基因COXImRNA來說，上調(diào)慢、維持時(shí)間短，說明失血性休克早期COXIV基因?qū)θ毖毖鯖]有COXI敏感。 5.復(fù)蘇加Rg1可上調(diào)PGC-1mRNA表達(dá)，復(fù)蘇加Rg1在SB202190或茴香霉素存在時(shí)，前者不能上調(diào)PGC-1mRNA及其蛋白表達(dá)，但后者使PGC-1mRNA及其蛋白表達(dá)量明顯增加，提示PGC-1mRNA上調(diào)可以促進(jìn)PGC-1蛋白表達(dá)，PG-C-1蛋白合成在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)非常重要。復(fù)蘇加Rg1不能上調(diào)NRF-1和m

16、tTFAmRNA表達(dá)，但Rg1與茴香霉素一起作用時(shí)均上調(diào)mtTFA和NRF-1mRNA表達(dá)，說明Rg1能減輕休克缺血缺氧所致細(xì)胞損傷，能有效維持細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞，為細(xì)胞的一些特異程序的完成提供了必要的條件。 6.復(fù)蘇加Rg1能增強(qiáng)COXI、COXⅣmRNA表達(dá)，復(fù)蘇加Rg1加SB202190或茴香霉素一起作用時(shí)均能上調(diào)COXI、COXⅣmRNA表達(dá)，表明三七皂甙單體Rg1可能是直接從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)線粒體編碼基因COXI、

17、核編碼COXⅣ基因mRNA，并有利于蛋白質(zhì)合成，改善線粒體功能，從而可減輕線粒體功能障礙所致缺血缺氧性細(xì)胞損傷。 7.復(fù)蘇加Rg1可顯著提高COX活性，可使其活性維持在較高水平，且在SB202190或茴香霉素存在時(shí)，仍然能提高COX活性，但復(fù)蘇加SB202190或茴香霉素均幾乎不提高該酶活性。說明三七皂甙單體Rg1可顯著提高COX活性。Rg1提高COX活性可能和提高該酶的產(chǎn)量和質(zhì)量有關(guān)。 8.復(fù)蘇加Rg1治療后，線粒體膜