肝癌局部免疫微環(huán)境狀態(tài)以及PEBP1分子表達(dá)影響肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)肝癌是第六位的常見腫瘤，在腫瘤相關(guān)死亡率中排第三位。我國是肝癌的高發(fā)國家之一，約占全球肝癌病例一半以上。肝癌的疾病過程進(jìn)展迅速、具有極高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向。雖然在肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究中已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，然而肝癌總體療效仍然不佳。既往的肝癌研究側(cè)重于研究肝癌本身的生物學(xué)行為，忽視了肝癌演進(jìn)過程中肝癌微環(huán)境中其他非腫瘤細(xì)胞作用。近年來逐漸重視從微環(huán)境與肝癌相互作用的角度進(jìn)行了研究，以試圖全面、深

2、刻認(rèn)識(shí)肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的內(nèi)在機(jī)制。
　　本研究的主要內(nèi)容從兩方面入手，一、從影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的外部原因，詳細(xì)研究了肝癌局部微環(huán)境的免疫狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)腫瘤局部微環(huán)境中免疫細(xì)胞表型以抑制性表型為主，并且影響著肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。二、從腫瘤內(nèi)在疾病基礎(chǔ)即基因的改變對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響。我們研究了在肝癌發(fā)生發(fā)展以及治療中具有重要作用的Raf/MEK/ERK信號(hào)通路上游分子PEBP1，發(fā)現(xiàn)了PEBP1在肝癌中的異常表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最后我

3、們通過聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤局部免疫狀態(tài)以及PEBP1的表達(dá)共同影響了肝癌進(jìn)展，并且提示PEBP1除了具有影響肝癌內(nèi)在的侵襲轉(zhuǎn)移潛能外，可能本身也參與了腫瘤的免疫逃避機(jī)制。
　　第一部分肝癌局部免疫微環(huán)境中相關(guān)免疫細(xì)胞表型研究
　　本研究旨在探索免疫細(xì)胞在肝癌患者體內(nèi)不同的微環(huán)境狀態(tài)下(外周血循環(huán)、癌旁肝臟和肝癌病灶局部微環(huán)境)的免疫細(xì)胞免疫表型與分布的差異。主要側(cè)重分析了在機(jī)體抗免疫功能中發(fā)揮著重要作用的CD8效應(yīng)性T細(xì)胞，以

4、及腫瘤免疫中占主要地位的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。同時(shí)我們也分析了其他相關(guān)免疫細(xì)胞CD4輔助性T細(xì)胞、γδT以及NKT及NK細(xì)胞等。
　　首先我們通過酶消化法以及Percoll梯度離心法，建立穩(wěn)定的獲取組織內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞分離方法。借助于流式細(xì)胞儀，配對(duì)比較分析了三處不同來源的免疫的表型與分布差異。
　　結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在肝癌外周血循環(huán)、癌旁肝臟和肝癌病灶局部的三處不同微環(huán)境中，免疫細(xì)胞的表型與分布是截然不同的，體現(xiàn)了不同的免疫功能狀態(tài)。具

5、體為：1.CD8效應(yīng)性T細(xì)胞的分布，肝癌病灶內(nèi)與外周血循環(huán)中的比例均顯著低于肝旁肝臟組織。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了相對(duì)于健康對(duì)照者，肝癌患者CD8效應(yīng)性T細(xì)胞共抑制分子BTLA增加，在成熟活化的記憶效應(yīng)T細(xì)胞階段時(shí)表達(dá)呈顯著上調(diào)，提示CD8細(xì)胞在肝癌患者體內(nèi)功能上是受抑制的。2.肝癌患者外周CD4+CD25+Treg顯著高于健康對(duì)照者。在肝癌患者體內(nèi)，肝癌局部微環(huán)境中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著高于外周和癌旁微環(huán)境，并且FoxP3的陽性

6、表達(dá)率以及表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于外周和癌旁肝臟。
　　另外我們還發(fā)現(xiàn)了CD4輔助性T細(xì)胞，與CD8T細(xì)胞分布情況截然相反，其在癌旁肝臟內(nèi)分布最低，而外周血和肝癌病灶內(nèi)均有較高的分布比例。固有免疫γδT細(xì)胞在腫瘤病灶內(nèi)比例下調(diào)。
　　本實(shí)驗(yàn)在離體活細(xì)胞水平，發(fā)現(xiàn)了在肝癌患者體內(nèi)，腫瘤局部微環(huán)境的免疫狀態(tài)是免疫抑制表型為主的，包括過繼免疫細(xì)胞CD8細(xì)胞減少，并且在成熟活化階段明顯受到抑制，而免疫抑制性Treg則在腫瘤局部顯著增加，同

7、時(shí)固有免疫γδT細(xì)胞的減少進(jìn)一步加重了腫瘤局部微環(huán)境的免疫狀態(tài)。
　　第二部分肝癌局部微環(huán)境免疫狀態(tài)對(duì)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響
　　在本研究中，我們對(duì)大樣本的臨床病例，通過組織芯片進(jìn)一步研究肝癌的局部微環(huán)境免疫狀態(tài)，以及對(duì)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響，并且通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)初步探討了Treg對(duì)肝癌侵襲能力的影響。
　　首先我們通過免疫組化的方法，在組織芯片上研究了240根治性肝癌切除標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤局部CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞顯著低于癌

8、旁微環(huán)境，而FoxP3+Treg在腫瘤局部浸潤顯著高于癌旁微環(huán)境。以CD8/Treg比值代表局部免疫狀態(tài)，單因素與多因素生存分析表明CD8/Treg比值是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)與總生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Treg浸潤程度與肝癌的惡性侵襲特征(血管侵犯、分化程度和腫瘤直徑)顯著相關(guān)，提示Treg可能具有促進(jìn)肝癌侵襲潛能的作用。進(jìn)一步通過Treg與肝癌細(xì)胞株體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Treg能在體外促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　本實(shí)驗(yàn)在免疫組

9、化水平證明了肝癌的局部微環(huán)境狀態(tài)以免疫抑制表型為主，即在肝癌局部CD8效應(yīng)性T細(xì)胞浸潤減少而Treg浸潤顯著增加。肝癌局部的免疫狀態(tài)(CD8/Treg比值)在肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)我們也證明了Treg能在體外促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　第三部分肝癌中PEBPl表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的相關(guān)研究
　　PEBP1是Raf蛋白抑制劑，調(diào)節(jié)包括Raf/MEK/ERK在內(nèi)的多種信號(hào)通路。PEBP1能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，并且在

10、腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。
　　本研究通過免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR法，檢測了240例原發(fā)性肝癌病例中PEBP1的蛋白和基因表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)PEBP1無論是蛋白水平還是基因水平在腫瘤內(nèi)表達(dá)顯著下調(diào)，并且下調(diào)的PEBP1與肝癌的侵襲性病理特征相關(guān)。通過單因素和多因素生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的PEBP1(無論是蛋白水平還是基因水平)是肝癌術(shù)后不良預(yù)后指標(biāo)。我們的結(jié)論在另外一組403例肝癌病例中進(jìn)一步得到驗(yàn)證。通過與肝癌局部免疫狀態(tài)的聯(lián)合分析

11、，我們發(fā)現(xiàn)PEBPI與CD8/Treg比值，都是肝癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，并且肝癌PEBP1的表達(dá)差異影響了CD8/Treg預(yù)后的價(jià)值。通過Western blot實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中PEBP1表達(dá)下降，與Raf/MEK/ERK信號(hào)異?；罨@著相關(guān)。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)PEBP1在肝癌內(nèi)表達(dá)顯著下降，是肝癌不良預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。肝癌中的PEBP1的低表達(dá)不僅與腫瘤的惡性侵襲能力相關(guān)，我們的研究也提示PEBP1也參與了腫瘤免疫逃避的機(jī)制