日本腦炎病毒NJ2008株人工突變致弱及其N-糖基化位點的功能研究.pdf

1、日本腦炎(Japanese Encephalitis，JE)，又稱流行性乙型腦炎(EpidemicEncephalitis B)，是由日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病，與西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)和登革熱病毒(Dengue Virus，DENV)等同屬于黃病毒科黃病毒屬。JEV在鳥與蚊子之間有一個區(qū)域性傳播循環(huán)，豬作為中間擴增

2、宿主，帶毒蚊子通過叮咬將感染性病毒傳播給人。該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害主要表現(xiàn)為夏秋季節(jié)母豬的繁殖障礙與公豬的睪丸炎，在我國流行面積較大，近年來經(jīng)濟損失較為嚴重，因此預防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。由于現(xiàn)階段對于乙腦尚無治療的特效手段，因此預防乙腦的發(fā)生尤為重要，而疫苗是控制該病發(fā)生的最佳手段。尋求穩(wěn)定、安全的豬用乙腦疫苗，已經(jīng)成為近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遺傳操作(又稱感染性克隆)為在DNA水平上研究RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)

3、及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段，進而深入研究RNA病毒的本質(zhì)和開發(fā)新產(chǎn)品。自反向遺傳操作技術(shù)在乙腦病毒上應用以來，在對乙腦病毒致病機理、分子表達調(diào)控機制、細胞生長特性、毒力決定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明顯進展。本研究構(gòu)建了兩個突變感染性克隆株(突變E138、N154)，分別在細胞和動物模型上驗證其毒力的變化，為豬源乙型腦炎病毒減毒活疫苗的研制提供了一個良好平臺；同時構(gòu)建突變N154的重組真核質(zhì)粒，通過其對小鼠細胞免疫水平

4、、體液免疫水平以及免疫保護力的檢測，評價其作為改良核酸疫苗的潛能。研究主要從以下幾方面展開：
　　 ⑴豬源乙型腦炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析。豬源乙型腦炎病毒NJ2008株是從南京某豬場流產(chǎn)胎兒的腦組織中分離并在BHK-21細胞上經(jīng)數(shù)次傳代，本實驗根據(jù)乙型腦炎病毒SH0601株的基因組序列設(shè)計并合成JEV特異性引物進而應用RT-PCR技術(shù)分11段擴增了JEV NJ2008株基因，將所得片段克隆至pMD18-T載體上，

5、經(jīng)測序后獲得了JEV基因組全序列。序列分析表明，該JEV基因組全長10，961bp，含有一個大的開放閱讀框架，編碼由3432個氨基酸殘基組成的聚合蛋白，其5’非編碼區(qū)(5’UTR)和3’非編碼區(qū)(3’UTR-)分別由95和578個堿基組成，與其它毒株比較發(fā)現(xiàn)3’非編碼區(qū)(3’UTR)的44bp處共缺少16個堿基。通過全基因和E基因的進化樹分析可得，豬源乙腦NJ2008株病毒屬于基因Ⅲ型，該病毒的全基因與其它32株病毒核苷酸進行比較發(fā)現(xiàn)，

6、同源性在99.4％和88％之間，與其它45株病毒E蛋白的核苷酸比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99.2％和87.7％之間；該病毒的全基因與其它32株病毒氨基酸進行比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99％和89.1％之間，與其它45株病毒E蛋白的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99.5％和89.7％之間，突變位點分散于各個區(qū)域。與其它16株豬源乙腦病毒E蛋白的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，E蛋白的309位氨基酸發(fā)生了突變，由酪氨酸(Tyr)-絲氨酸(Ser)，并且307-309位為乙型腦炎

7、病毒E蛋白的一個B細胞線形表位。
　　 ⑵豬源乙型腦炎病毒NJ2008株感染性克隆的構(gòu)建及鑒定。本實驗根據(jù)豬源乙型腦炎病毒NJ2008株基因組序列設(shè)計并合成JEV特異性引物，進而應用RT-PCR技術(shù)分4段擴增了IEV NJ2008株全基因組cDNA。將擴增的1、2兩個片段通過重疊PCR的方法擴增出JEV5’cDNA，將擴增的3、4兩個片段通過重疊PCR的方法擴增出JEV3’cDNA。在擴增5’前端時，引入T7啟動子序列用于后期的

8、體外轉(zhuǎn)錄得到病毒的轉(zhuǎn)錄本，在基因組5’前端和3’末段分別引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位點，最后將5'cDNA和3’cDNA連入pBluescriptⅡKS載體，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pSK-SUP、pSK-HYPO。進一步的酶切鑒定及接頭處序列測定的結(jié)果表明，成功獲得了NJ2008株基因組全長cDNA克隆。用SalⅠ、BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pSK-SUP，用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒pSK-HYPO，然后通過體外連接獲得全長基因組.

9、體外連接的全長基因組轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA，轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，72h后將轉(zhuǎn)染病毒RNA細胞凍溶1次后接種BHK-21細胞，拯救出病毒。通過間接免疫熒光證明病毒拯救成功，并且比較親本病毒與拯救病毒的病毒滴度、多步生長曲線，發(fā)現(xiàn)病毒學及分子生物學特性沒有顯著差異。通過測序分析，拯救病毒的氨基酸與親本毒共有3個氨基酸的差異，尚沒有文獻報道該病毒的毒力與這3個氨基酸有關(guān)。以上結(jié)果表明JEV強毒株NJ2008株感染性克隆構(gòu)建成功，建立了JEV疫苗

10、株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究JEV的分子生物學以及致病機制提供了技術(shù)平臺。
　　 ⑶豬源乙腦病毒E138位突變株感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救。日本腦炎病毒E蛋白的138位氨基酸對于該病毒的毒力強弱起到至關(guān)重要的作用，所以本研究以乙腦病毒NJ2008株全長感染性克隆為親本，利用反向遺傳技術(shù)將該病毒的E蛋白138位谷氨酸(Glu)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，構(gòu)建了突變株的全基因感染性克隆。將其轉(zhuǎn)染乳倉鼠腎細胞(BHK-21)，72h后出現(xiàn)

11、病變，并在BHK-21細胞中盲傳3代，通過病毒蝕斑形成試驗、間接免疫熒光和熒光定量RT-PCR等方法與親本感染性克隆株對比分析其感染性的差異。結(jié)果表明，突變病毒的蝕斑數(shù)和熒光數(shù)明顯比親本株少，在感染2～3d后，細胞內(nèi)病毒RNA的量大約是親本株的1/3。另外，在小鼠腦內(nèi)接種同劑量的親本株病毒和E138突變感染性克隆病毒，接種E138突變感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。該實驗將為豬源乙型腦炎病毒減毒活疫苗的研制提供了一個良好平臺。<

12、br>　　 ⑷豬源乙腦病毒NJ2008株N-糖基化位點的突變影響病毒的復制、胞內(nèi)定位以及致病力。日本腦炎病毒E蛋白僅含有一個糖基化位點，N154-N-T。已經(jīng)有文獻報道，有些病毒E蛋白糖基化位點的改變會影響病毒的形態(tài)、感染力以及免疫應答，但乙型腦炎病毒該位點的突變是否影響病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙腦病毒NJ2008株全長感染性克隆為親本，利用反向遺傳技術(shù)將該病毒的E蛋白154位天冬酰胺(Ash)突變?yōu)楸彼?Ala)

13、，構(gòu)建了N154突變株的感染性克隆。將其轉(zhuǎn)染乳倉鼠腎細胞(BHK-21)，72h后出現(xiàn)病變，并在BHK-21細胞中盲傳3代，通過病毒蝕斑形成試驗、間接免疫熒光和熒光定量RT-PCR等方法與親本株病毒對比分析其感染性的差異。結(jié)果表明，突變病毒的蝕斑數(shù)和熒光散明顯比親本株少，在感染2～3d后，細胞內(nèi)病毒RNA的量大約是親本株的1/2。通過激光共聚焦顯微鏡觀察到，在感染BHK-21細胞的早期(24h)，突變N154病毒與親本毒的蛋白在細胞內(nèi)的

14、定位有所不同，突變N154病毒的蛋白在細胞中呈現(xiàn)明顯的聚積。突變株病毒腦內(nèi)接種乳鼠，對乳鼠致病力有所下降。由此可以看出，E蛋白糖基化位點的突變降低了乙腦病毒的復制、影響了蛋白在胞內(nèi)的折疊以及降低了病毒的致病力，這也將為豬源乙型腦炎病毒弱毒疫苗致弱機理的作用研究而奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 ⑸豬源乙腦病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位點突變體的真核質(zhì)粒構(gòu)建。PrM和E蛋白是乙型腦炎病毒兩個重要的囊膜蛋白，將prM、E基因及prM的信號

15、肽序列插入真核表達質(zhì)粒pVAXI中構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAXI-prME，其中prM和E各含有一個糖基化位點(N15，N154)，單獨或聯(lián)合突變其糖基化位點，將天冬酰胺(N)突變成丙氨酸(A)，構(gòu)建3株突變的重組真核質(zhì)粒PVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VERO細胞，利用間接免疫熒光證明親本與3株突變的重組質(zhì)粒在真核細胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達；通過肽N-糖苷酶F(PNGase F

16、)作用后，Western-blot檢測表明突變糖基化位點的重組真核質(zhì)粒表達產(chǎn)物的分子量小于親本質(zhì)粒的表達產(chǎn)物，并而這些重組質(zhì)粒都能與JEV單克隆抗體特異性結(jié)合，證明其具有一定的生物學活性和抗原性。
　　 ⑹豬源乙腦病毒prM、E蛋白N-糖基化位點對Balb/c小鼠的特異性免疫影響。為了評價構(gòu)建的親本和突變重組真核質(zhì)粒的免疫效力，將這4株重組真核質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。將6周齡Balb/c小鼠隨機分成5組，每組14

17、只，設(shè)pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-orME-M2、pVAXI-prME-M3共4個免疫組，同時設(shè)pVAXI空載體對照組，肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為100μg/只。然后通過測定抗體水平、抗體亞型、中和抗體和細胞因子(IL-4，IL-2和IFN-γ)，并做了攻毒保護試驗來衡量突變N154的重組質(zhì)粒的免疫效果。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3，即突變E基因的N1

18、54后，既能誘導體液免疫又能誘導細胞免疫，且體液免疫水平比pVAXI-prME高.抗體亞型分析結(jié)果表明，突變N154的重組質(zhì)粒既能誘導IgG1的分泌又能誘導IgG2a的分泌，但以IgG1為主；同時細胞因子檢測結(jié)果進一步表明突變N154的重組質(zhì)粒主要誘導Th2型細胞因子(IL-4)的產(chǎn)生，因此說明其主要誘導產(chǎn)生Th2型免疫應答。攻毒實驗結(jié)果表明重組質(zhì)粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3能完全保護小鼠免受致死量的乙腦病毒