日本腦炎病毒NJ2008株人工突變致弱及其N-糖基化位點(diǎn)的功能研究.pdf

1、日本腦炎(Japanese Encephalitis，JE)，又稱流行性乙型腦炎(EpidemicEncephalitis B)，是由日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病，與西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)和登革熱病毒(Dengue Virus，DENV)等同屬于黃病毒科黃病毒屬。JEV在鳥與蚊子之間有一個(gè)區(qū)域性傳播循環(huán)，豬作為中間擴(kuò)增

2、宿主，帶毒蚊子通過(guò)叮咬將感染性病毒傳播給人。該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害主要表現(xiàn)為夏秋季節(jié)母豬的繁殖障礙與公豬的睪丸炎，在我國(guó)流行面積較大，近年來(lái)經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重，因此預(yù)防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。由于現(xiàn)階段對(duì)于乙腦尚無(wú)治療的特效手段，因此預(yù)防乙腦的發(fā)生尤為重要，而疫苗是控制該病發(fā)生的最佳手段。尋求穩(wěn)定、安全的豬用乙腦疫苗，已經(jīng)成為近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遺傳操作(又稱感染性克隆)為在DNA水平上研究RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)

3、及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段，進(jìn)而深入研究RNA病毒的本質(zhì)和開發(fā)新產(chǎn)品。自反向遺傳操作技術(shù)在乙腦病毒上應(yīng)用以來(lái)，在對(duì)乙腦病毒致病機(jī)理、分子表達(dá)調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞生長(zhǎng)特性、毒力決定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明顯進(jìn)展。本研究構(gòu)建了兩個(gè)突變感染性克隆株(突變E138、N154)，分別在細(xì)胞和動(dòng)物模型上驗(yàn)證其毒力的變化，為豬源乙型腦炎病毒減毒活疫苗的研制提供了一個(gè)良好平臺(tái)；同時(shí)構(gòu)建突變N154的重組真核質(zhì)粒，通過(guò)其對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平

4、、體液免疫水平以及免疫保護(hù)力的檢測(cè)，評(píng)價(jià)其作為改良核酸疫苗的潛能。研究主要從以下幾方面展開：
　　 ⑴豬源乙型腦炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析。豬源乙型腦炎病毒NJ2008株是從南京某豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒的腦組織中分離并在BHK-21細(xì)胞上經(jīng)數(shù)次傳代，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)乙型腦炎病毒SH0601株的基因組序列設(shè)計(jì)并合成JEV特異性引物進(jìn)而應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分11段擴(kuò)增了JEV NJ2008株基因，將所得片段克隆至pMD18-T載體上，

5、經(jīng)測(cè)序后獲得了JEV基因組全序列。序列分析表明，該JEV基因組全長(zhǎng)10，961bp，含有一個(gè)大的開放閱讀框架，編碼由3432個(gè)氨基酸殘基組成的聚合蛋白，其5’非編碼區(qū)(5’UTR)和3’非編碼區(qū)(3’UTR-)分別由95和578個(gè)堿基組成，與其它毒株比較發(fā)現(xiàn)3’非編碼區(qū)(3’UTR)的44bp處共缺少16個(gè)堿基。通過(guò)全基因和E基因的進(jìn)化樹分析可得，豬源乙腦NJ2008株病毒屬于基因Ⅲ型，該病毒的全基因與其它32株病毒核苷酸進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，

6、同源性在99.4％和88％之間，與其它45株病毒E蛋白的核苷酸比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99.2％和87.7％之間；該病毒的全基因與其它32株病毒氨基酸進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99％和89.1％之間，與其它45株病毒E蛋白的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，同源性在99.5％和89.7％之間，突變位點(diǎn)分散于各個(gè)區(qū)域。與其它16株豬源乙腦病毒E蛋白的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，E蛋白的309位氨基酸發(fā)生了突變，由酪氨酸(Tyr)-絲氨酸(Ser)，并且307-309位為乙型腦炎

7、病毒E蛋白的一個(gè)B細(xì)胞線形表位。
　　 ⑵豬源乙型腦炎病毒NJ2008株感染性克隆的構(gòu)建及鑒定。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)豬源乙型腦炎病毒NJ2008株基因組序列設(shè)計(jì)并合成JEV特異性引物，進(jìn)而應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分4段擴(kuò)增了IEV NJ2008株全基因組cDNA。將擴(kuò)增的1、2兩個(gè)片段通過(guò)重疊PCR的方法擴(kuò)增出JEV5’cDNA，將擴(kuò)增的3、4兩個(gè)片段通過(guò)重疊PCR的方法擴(kuò)增出JEV3’cDNA。在擴(kuò)增5’前端時(shí)，引入T7啟動(dòng)子序列用于后期的

8、體外轉(zhuǎn)錄得到病毒的轉(zhuǎn)錄本，在基因組5’前端和3’末段分別引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，最后將5'cDNA和3’cDNA連入pBluescriptⅡKS載體，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pSK-SUP、pSK-HYPO。進(jìn)一步的酶切鑒定及接頭處序列測(cè)定的結(jié)果表明，成功獲得了NJ2008株基因組全長(zhǎng)cDNA克隆。用SalⅠ、BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pSK-SUP，用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒pSK-HYPO，然后通過(guò)體外連接獲得全長(zhǎng)基因組.

9、體外連接的全長(zhǎng)基因組轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，72h后將轉(zhuǎn)染病毒RNA細(xì)胞凍溶1次后接種BHK-21細(xì)胞，拯救出病毒。通過(guò)間接免疫熒光證明病毒拯救成功，并且比較親本病毒與拯救病毒的病毒滴度、多步生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)病毒學(xué)及分子生物學(xué)特性沒(méi)有顯著差異。通過(guò)測(cè)序分析，拯救病毒的氨基酸與親本毒共有3個(gè)氨基酸的差異，尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道該病毒的毒力與這3個(gè)氨基酸有關(guān)。以上結(jié)果表明JEV強(qiáng)毒株NJ2008株感染性克隆構(gòu)建成功，建立了JEV疫苗

10、株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究JEV的分子生物學(xué)以及致病機(jī)制提供了技術(shù)平臺(tái)。
　　 ⑶豬源乙腦病毒E138位突變株感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救。日本腦炎病毒E蛋白的138位氨基酸對(duì)于該病毒的毒力強(qiáng)弱起到至關(guān)重要的作用，所以本研究以乙腦病毒NJ2008株全長(zhǎng)感染性克隆為親本，利用反向遺傳技術(shù)將該病毒的E蛋白138位谷氨酸(Glu)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，構(gòu)建了突變株的全基因感染性克隆。將其轉(zhuǎn)染乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，72h后出現(xiàn)

11、病變，并在BHK-21細(xì)胞中盲傳3代，通過(guò)病毒蝕斑形成試驗(yàn)、間接免疫熒光和熒光定量RT-PCR等方法與親本感染性克隆株對(duì)比分析其感染性的差異。結(jié)果表明，突變病毒的蝕斑數(shù)和熒光數(shù)明顯比親本株少，在感染2～3d后，細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的量大約是親本株的1/3。另外，在小鼠腦內(nèi)接種同劑量的親本株病毒和E138突變感染性克隆病毒，接種E138突變感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。該實(shí)驗(yàn)將為豬源乙型腦炎病毒減毒活疫苗的研制提供了一個(gè)良好平臺(tái)。<

12、br>　　 ⑷豬源乙腦病毒NJ2008株N-糖基化位點(diǎn)的突變影響病毒的復(fù)制、胞內(nèi)定位以及致病力。日本腦炎病毒E蛋白僅含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，N154-N-T。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，有些病毒E蛋白糖基化位點(diǎn)的改變會(huì)影響病毒的形態(tài)、感染力以及免疫應(yīng)答，但乙型腦炎病毒該位點(diǎn)的突變是否影響病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙腦病毒NJ2008株全長(zhǎng)感染性克隆為親本，利用反向遺傳技術(shù)將該病毒的E蛋白154位天冬酰胺(Ash)突變?yōu)楸彼?Ala)

13、，構(gòu)建了N154突變株的感染性克隆。將其轉(zhuǎn)染乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)，72h后出現(xiàn)病變，并在BHK-21細(xì)胞中盲傳3代，通過(guò)病毒蝕斑形成試驗(yàn)、間接免疫熒光和熒光定量RT-PCR等方法與親本株病毒對(duì)比分析其感染性的差異。結(jié)果表明，突變病毒的蝕斑數(shù)和熒光散明顯比親本株少，在感染2～3d后，細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的量大約是親本株的1/2。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到，在感染BHK-21細(xì)胞的早期(24h)，突變N154病毒與親本毒的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的

14、定位有所不同，突變N154病毒的蛋白在細(xì)胞中呈現(xiàn)明顯的聚積。突變株病毒腦內(nèi)接種乳鼠，對(duì)乳鼠致病力有所下降。由此可以看出，E蛋白糖基化位點(diǎn)的突變降低了乙腦病毒的復(fù)制、影響了蛋白在胞內(nèi)的折疊以及降低了病毒的致病力，這也將為豬源乙型腦炎病毒弱毒疫苗致弱機(jī)理的作用研究而奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 ⑸豬源乙腦病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位點(diǎn)突變體的真核質(zhì)粒構(gòu)建。PrM和E蛋白是乙型腦炎病毒兩個(gè)重要的囊膜蛋白，將prM、E基因及prM的信號(hào)

15、肽序列插入真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXI中構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pVAXI-prME，其中prM和E各含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)(N15，N154)，單獨(dú)或聯(lián)合突變其糖基化位點(diǎn)，將天冬酰胺(N)突變成丙氨酸(A)，構(gòu)建3株突變的重組真核質(zhì)粒PVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞，利用間接免疫熒光證明親本與3株突變的重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；通過(guò)肽N-糖苷酶F(PNGase F

16、)作用后，Western-blot檢測(cè)表明突變糖基化位點(diǎn)的重組真核質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的分子量小于親本質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物，并而這些重組質(zhì)粒都能與JEV單克隆抗體特異性結(jié)合，證明其具有一定的生物學(xué)活性和抗原性。
　　 ⑹豬源乙腦病毒prM、E蛋白N-糖基化位點(diǎn)對(duì)Balb/c小鼠的特異性免疫影響。為了評(píng)價(jià)構(gòu)建的親本和突變重組真核質(zhì)粒的免疫效力，將這4株重組真核質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。將6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組14

17、只，設(shè)pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-orME-M2、pVAXI-prME-M3共4個(gè)免疫組，同時(shí)設(shè)pVAXI空載體對(duì)照組，肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為100μg/只。然后通過(guò)測(cè)定抗體水平、抗體亞型、中和抗體和細(xì)胞因子(IL-4，IL-2和IFN-γ)，并做了攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)衡量突變N154的重組質(zhì)粒的免疫效果。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3，即突變E基因的N1

18、54后，既能誘導(dǎo)體液免疫又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，且體液免疫水平比pVAXI-prME高.抗體亞型分析結(jié)果表明，突變N154的重組質(zhì)粒既能誘導(dǎo)IgG1的分泌又能誘導(dǎo)IgG2a的分泌，但以IgG1為主；同時(shí)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明突變N154的重組質(zhì)粒主要誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子(IL-4)的產(chǎn)生，因此說(shuō)明其主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組質(zhì)粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3能完全保護(hù)小鼠免受致死量的乙腦病毒