骨髓增生異常綜合征的分層診斷及去甲基化分段治療.pdf

1、第一部分:Th22細胞和Th17細胞在骨髓增生異常綜合征中的差異化表達及其調(diào)控機制研究
　　研究背景:
　　骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組克隆性造血干/祖細胞疾病，主要表現(xiàn)為病態(tài)造血和高風險性向急性白血病進展。在MDS的發(fā)生、發(fā)展過程中，自身免疫介導的骨髓抑制及具有清除惡性克隆功能的免疫監(jiān)視系統(tǒng)起重要作用。T淋巴細胞克隆性擴增，臨床上免疫調(diào)節(jié)治療效果可，均提示T輔助細胞和細胞毒性T細胞參與構(gòu)成MDS的異常免疫系統(tǒng)。

2、>　　近來，一種新的能夠產(chǎn)生IL-17并特異性表達轉(zhuǎn)錄因子RORC的T輔助細胞被人們發(fā)現(xiàn)，隨即被命名為Th17細胞。Th17細胞在炎癥免疫反應(yīng)中的研究日益深入。IL-17A是Th17細胞的主要效應(yīng)因子，被認為是多種免疫異常疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性骨髓瘤等的致病因素之一。有研究顯示低危MDS患者外周血中Th17細胞表達升高，但其異常細胞免疫的發(fā)生機制仍不明朗。
　　Th22細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的CD4+T淋巴細

3、胞亞群，其特點是分泌IL-22和TNF-α，而非IL-17或IFN-γ，亦不表達轉(zhuǎn)錄因子T-bet或RORC。在IL-6和TNF-α的促進作用下，芳香烴受體活化，初始性CD4+T細胞可以向Th22表型方向分化。有研究表明在炎癥性皮膚異常病人中Th22細胞能夠滲透進入表皮組織并參與調(diào)節(jié)表皮的炎癥反應(yīng)。Th22細胞表達水平亦被證實與胃癌疾病進展密切相關(guān)。綜上所述，Th22細胞在炎癥免疫和腫瘤免疫逃逸機制中均發(fā)揮重要作用。
　　IL-2

4、2是一種IL-10家族細胞因子，可由活化的Th22和Th17細胞分泌。IL-22在炎癥免疫反應(yīng)和惡性腫瘤中的表達趨勢不盡相同:它既可以與IL-17發(fā)揮協(xié)同作用，也可以獨立發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在炎癥性皮膚病和間變性淋巴瘤激酶陽性的間變性大細胞淋巴瘤患者中IL-22表達上調(diào)，定向誘導免疫系統(tǒng)攻擊自身的靶組織細胞。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的IL-22表達下調(diào)。在炎癥性腸病中，經(jīng)由未致敏細胞或記憶-效應(yīng)細胞的誘導，在不同微環(huán)境下IL-22既能夠抑制炎癥

5、反應(yīng)又可以促進炎癥發(fā)生發(fā)展。
　　迄今為止，尚未出現(xiàn)MDS中Th22細胞亞群相關(guān)的報道。為探究Th22細胞在MDS疾病發(fā)生發(fā)展中的致病機制，我們檢測了早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th22、Th17及Th1細胞的表達情況;同時檢測了外周血單個核細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC和調(diào)節(jié)因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的表達水平;并且檢測了外周血血漿和骨髓上清中IL-22和IL-17的含量。此外，我們將不同的T細胞亞群

6、進行了相關(guān)性分析，探討Th細胞分化與MDS疾病預后分期的關(guān)系。
　　研究目的:
　　通過檢測MDS患者外周血中Th22、Th17細胞所占的比例及轉(zhuǎn)錄因子RORC，調(diào)節(jié)因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的表達水平，研究調(diào)節(jié)性因子對早期MDS、晚期MDS患者外周血輔助性T細胞亞群Th22/Th17表達量的影響，探討不同臨床分期MDS患者的炎癥免疫或免疫逃逸狀態(tài)，從預后分期的角度尋找可以協(xié)助早期、晚期MDS臨床診斷的免疫

7、學指標。
　　研究方法:
　　1.收集17例早期MDS患者、20例晚期MDS患者及20例健康志愿者的外周血，同時采集25例MDS患者及10例腫瘤學炎癥免疫學方面無異常的外科患者的骨髓。
　　2.通過流式細胞術(shù)檢測外周血Th22、Th17和Th1細胞在輔助性T細胞亞群中所占的比例。
　　3.采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA)檢測外周血血漿和骨

8、髓上清中細胞因子IL-22和IL-17的濃度。
　　4.分離早期MDS、晚期MDS患者及健康志愿者的外周血單個核細胞，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定調(diào)節(jié)因子RORC、IL-6、TNF-α、IL-23mRNA的表達水平。
　　5.統(tǒng)計分析:根據(jù)是否服從正態(tài)分布，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)或者中位數(shù)（數(shù)值區(qū)間）表示。比較兩組數(shù)值變量之間的差異性時，根據(jù)數(shù)值變量是否服從正態(tài)分布，選擇獨立樣本t檢驗或非參

9、數(shù)檢驗進行分析。早期MDS、晚期MDS以及健康對照組三組之間比較差異性時，使用one-wayANOVA進行分析統(tǒng)計，其中任意兩組之間比較差異性時用Newman-Keuls檢驗（q檢驗）兩兩比較法進行分析統(tǒng)計;當任何一組數(shù)值變量不符合正態(tài)分布時，應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）和Nemenyi檢驗進行分析統(tǒng)計。進行變量之間的相關(guān)性分析時，根據(jù)雙變量是否均服從正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)或Spearman等級相關(guān)方法進行分析

10、統(tǒng)計。所有統(tǒng)計分析均使用SAS9.1軟件進行。P＜0.05定為具有統(tǒng)計學差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th22細胞的表達情況
　　與正常對照組(0.71±0.17％)相比，Th22（CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+）細胞亞群在所有分期MDS患者外周血中所占比例顯著增加(1.55±0.74％，P＜0.0001);Th22細胞在早期MDS患者外周血中所占的比例顯著

11、高于對照組(1.27±0.50％vs.0.71±0.17％，P=0.002);與早期MDS患者相比，晚期MDS患者Th22細胞的表達量明顯升高(1.77±0.84％vs.1.27±0.50％，P=0.03)。
　　2.早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th17細胞的表達情況
　　Th17(CD4+IL17+)細胞亞群在早期MDS患者外周血中所占的比例(1.90％;0.58-6.01％)顯著高于晚期MDS組(1.1

12、6％;0.15-1.86％;P=0.002)以及對照組(0.97％;0.55-1.69％;P=0.002)。
　　3.MDS患者和健康志愿者外周Th1細胞的表達情況
　　外周血中Th1(CD4+IFN-γ+)細胞亞群在外周血中占輔助性T細胞的比例在MDS組以及對照組之間無明顯差異。
　　4.MDS組和對照組血漿和骨髓上清中IL-22和IL-17的水平血漿中IL-22的濃度在MDS組和健康對照組之間無顯著性差異。骨髓上清

13、中IL-22的濃度在兩組之間亦無顯著性差異。MDS組及健康對照組血漿中IL-17的濃度無統(tǒng)計學差異，骨髓上清中IL-17的濃度亦無統(tǒng)計學差異。
　　5.早期MDS組、晚期MDS組和對照組外周血單個核細胞中轉(zhuǎn)錄因子RORC和調(diào)節(jié)因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的相對定量表達。
　　在早期MDS組、晚期MDS組和健康對照組三組中，外周血單個核細胞轉(zhuǎn)錄因子RORC基因僅在早期MDS組表達明顯升高(P=0.0007;P=

14、0.002)，外周血單個核細胞中調(diào)節(jié)性細胞因子IL-6及TNF-α基因僅在晚期MDS組表達顯著增高(P＜0.05;P＜0.001);外周血單個核細胞中IL-23基因表達水平在三組之間均無統(tǒng)計學差異。
　　6.MDS患者外周T細胞亞群Th22、Th17及Th1細胞之間的關(guān)聯(lián)性
　　在早期MDS患者中，外周Th22與Th17細胞亞群的數(shù)目比例呈正相關(guān)(r=0.675，P=0.004);然而，在晚期MDS患者中，外周Th22細胞與

15、Th17細胞亞群的分化表達量無相關(guān)性(r=0.138，P=0.610)。在總體所有分期的MDS患者中，外周Th22亞群與Th1亞群的表達無相關(guān)性（P=0.053）。
　　結(jié)論:
　　早期MDS患者外周血中輔助性T細胞向Th17亞群方向的分化量、轉(zhuǎn)錄因子RORCmRNA表達量顯著增加;晚期MDS患者外周血中輔助性T細胞向Th22亞群方向的分化量、IL-6mRNA和TNF-αmRNA表達量顯著增加，提示Th22/Th17細胞參與

16、調(diào)節(jié)早期MDS炎癥免疫和晚期MDS免疫逃逸的異常免疫狀態(tài)。就疾病分期而言，外周血中Th22/Th17比率對于早期、晚期MDS的分層診斷具有重要的免疫學指示意義。
　　第二部分：地西他濱分段治療骨髓增生異常綜合征及療效評估體系
　　研究背景:
　　表觀遺傳學是指在不涉及核苷酸序列變化的情形下基因表達發(fā)生了改變，包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾等。細胞遺傳學變化是MDS主要的發(fā)病機制，此外，單倍劑量不足、次級突變及

17、表觀遺傳學改變等亦是MDS重要的致病機理。研究表明MDS表觀遺傳學改變主要表現(xiàn)為造血祖細胞內(nèi)基因組水平上廣泛的DNA甲基化和組蛋白乙酰化、甲基化，集中發(fā)生在抑癌基因及其他有絲分裂抑制因子的轉(zhuǎn)錄表達區(qū)域。高危型MDS異常甲基化位點的數(shù)目比低危型MDS異常甲基化位點多。轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和TET2異常甲基化比較普遍。DNMTs可以催化CpG島中胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶，是MDS治療的關(guān)鍵靶點。
　　研究表明大

18、劑量地西他濱具有細胞毒性，小劑量地西他濱則可以抑制DNMTs的活性，發(fā)揮去甲基化功能，使沉默的抑癌基因如E-cadherin，P16，hMLH1，VHL，P15，P21等恢復正常去甲基化狀態(tài)而重新活化表達。
　　美國食品藥品監(jiān)督管理局推薦DNMTs抑制劑地西他濱在臨床上適用于治療IPSS-R預后中危/高危/極高危MDS及其他治療無效的較低危MDS。多項回顧性臨床研究和前瞻性隊列研究表明地西他濱可以使部分較高危MDS患者獲得細胞遺傳

19、學改善，降低MDS向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風險，延長總生存期。但在地西他濱實際應(yīng)用過程中，骨髓抑制發(fā)生率較高且多為Ⅲ或Ⅳ級，主要表現(xiàn)為血小板減少、中性粒細胞減少和貧血。
　　鑒于地西他濱傳統(tǒng)治療體系中常發(fā)生延遲給藥或提前中止療程，為進一步提高地西他濱的療效，我們探索出一套分段治療及療效評估體系，現(xiàn)對該體系做一詳細說明，并同傳統(tǒng)地西他濱治療體系進行比較分析。
　　研究目的:
　　論證研究地西他濱分段治療及療效評估體系的合理

20、性、可行性及安全性，分析比較地西他濱傳統(tǒng)治療體系與分段治療評估體系治療骨髓增生異常綜合征的有效性。
　　研究方法:
　　研究對象選擇山東大學齊魯醫(yī)院2012年2月至2013年12月確診為MDS的57例患者。24例患者接受傳統(tǒng)小劑量地西他濱治療方案:應(yīng)用地西他濱20mg/平方米/天，靜脈輸注，連續(xù)5天，4周一療程。在地西他濱治療第2療程后復查骨髓細胞學和外周血象，評價骨髓和血液學緩解情況，評估療效。33位MDS患者接受小劑量地

21、西他濱分段治療及療效評估體系治療:用藥劑量同前;首次應(yīng)用地西他濱前根據(jù)MDS患者基線特征評估情況，加強支持治療，并同時進行抗微生物“三聯(lián)”預防。治療第2療程完后監(jiān)測血小板計數(shù)變化情況，第3療程后復查骨髓原始細胞數(shù)、外周血象，評估療效。第4療程后進行鞏固治療，第6療程后進入維持治療。
　　第1療程后，統(tǒng)計分析傳統(tǒng)治療組和分段治療評估組兩組之間在3～4級血液學副反應(yīng)及感染發(fā)生率方面有無差異，分析比較兩組之間在延遲給藥發(fā)生率、提前中止治

22、療發(fā)生率等方面有無差異;第2療程結(jié)束后重點關(guān)注血小板變化情況，動態(tài)監(jiān)測血小板數(shù)目，分析比較兩組中血小板改善情況;第3療程后分段治療評估組進行骨髓原始細胞數(shù)和外周血象復查，傳統(tǒng)治療組已在第2療程后復查骨髓原始細胞數(shù)和外周血象，統(tǒng)計分析兩組中地西他濱治療的總有效率(overall response rate，ORR)是否存在統(tǒng)計學差異，ORR評價指標包括完全緩解(complete remission，CR)率和部分緩解(partial re

23、mission，PR)率。比較兩組輸血依賴情況及地西他濱中位療程數(shù)有無統(tǒng)計學差異。
　　研究結(jié)果:
　　1.地西他濱傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系第一療程后發(fā)生感染的情況
　　傳統(tǒng)治療組地西他濱應(yīng)用第一療程后發(fā)生感染的機率為66.7％，分段治療組第一療程后發(fā)生感染的機率為39.4％，P=0.042＜0.05，傳統(tǒng)治療組與分段治療組MDS患者并發(fā)感染的機率具有統(tǒng)計學差異。
　　2.地西他濱傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估

24、體系第一療程后發(fā)生3～4級中性粒細胞減少的情況
　　傳統(tǒng)治療組不良反應(yīng)-3～4級中性粒細胞減少的發(fā)生率為33.3％，分段治療組3～4級中性粒細胞減少的發(fā)生率為9.1％，P=0.039＜0.05，分段治療組和傳統(tǒng)治療組3～4級中性粒細胞減少發(fā)生率具有顯著統(tǒng)計學差異。
　　3.地西他濱傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系第一療程后發(fā)生3～4級血小板減少的情況
　　傳統(tǒng)治療組不良反應(yīng)3～4級血小板減少的發(fā)生率為50.0％，分段治療

25、組3～4級血小板減少的發(fā)生率為24.2％，P=0.044＜0.05，說明分段治療組和傳統(tǒng)治療組3～4級血小板減少發(fā)生率具有顯著統(tǒng)計學差異。
　　4.地西他濱傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系第一療程后發(fā)生3～4級貧血的情況
　　傳統(tǒng)治療組不良反應(yīng)3～4級貧血的發(fā)生率為29.2％，分段治療組3～4級貧血的發(fā)生率為6.1％，P=0.027＜0.05，說明分段治療組和傳統(tǒng)治療組3～4級貧血發(fā)生率具有統(tǒng)計學差異。
　　5.地西他濱

26、傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系一療程后延遲給藥和中止治療的發(fā)生情況
　　傳統(tǒng)治療組地西他濱應(yīng)用一療程后延遲給藥發(fā)生率為66.7％，分段治療組治療過程中延遲給藥發(fā)生率為36.4％，P=0.024＜0.05，說明分段治療組和傳統(tǒng)治療組地西他濱應(yīng)用一療程后延遲給藥發(fā)生率具有統(tǒng)計學差異。一療程后中止治療的發(fā)生率沒有統(tǒng)計學差異。
　　6.地西他濱傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系治療反應(yīng)的對比
　　傳統(tǒng)治療組及分段治療組地西他濱的總

27、有效率ORR(CR％+PR％)分別為12.5％和36.4％，P=0.043＜0.05，分段治療及療效評估體系可以顯著提高地西他濱治療的有效率。
　　傳統(tǒng)治療組血小板改善率為41.7％，分段治療組血小板改善率為69.7％，P=0.034＜0.05，分段治療組和傳統(tǒng)治療組MDS患者獲得血小板改善的機率具有顯著統(tǒng)計學差異，分段治療及療效評估體系中MDS患者的血小板反應(yīng)更佳。傳統(tǒng)治療組和分段治療組兩組中MDS患者的血小板數(shù)目均比其自身的中

28、性粒細胞數(shù)目和血紅蛋白含量恢復得早。分段治療組獲得血小板改善的MDS患者其血小板計數(shù)水平多在第2-3療程開始回升，而傳統(tǒng)治療組獲得血小板改善的MDS患者其血小板計數(shù)水平常在第3、4療程開始回升。
　　在地西他濱傳統(tǒng)治療組中，治療前輸血依賴者13例，治療后輸血依賴者9例，脫離輸血依賴患者的比例為30.8％。在地西他濱分段治療組中，治療前輸血依賴者24例，治療后輸血依賴者8例，脫離輸血依賴患者的比例為66.7％，P=0.036，分段治

29、療評估體系中更高比例的患者脫離輸血依賴，輸血頻次或輸血量較大幅度地減低。
　　7.傳統(tǒng)治療體系和分段治療評估體系地西他濱中位療程數(shù)對比
　　傳統(tǒng)治療組MDS患者使用地西他濱治療的療程數(shù)是1-5，中位療程數(shù)是4;分段治療組MDS患者使用地西他濱治療的療程數(shù)是2-8，中位療程數(shù)是7。比較兩組之間中位療程數(shù)的差異，P＜0.01，提示分段治療及療效評估體系可以確保地西他濱療程的銜接性。
　　結(jié)論:
　　與地西他濱傳統(tǒng)治療