NCOA5在腎癌中的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的：檢測腎上皮細(xì)胞株293、HK2，腎癌細(xì)胞株ACHN、OS-RC-2，以及腎癌組織中NCOA5的表達(dá)，分析NCOA5與腎癌患者臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系；建立高表達(dá)NCOA5的腎癌穩(wěn)定株細(xì)胞，研究NCOA5對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法：
　　(1)用Western blot檢測腎上皮細(xì)胞株293、HK2，腎癌細(xì)胞株ACHN、OS-RC-2中NCOA5的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析腎上皮細(xì)胞與腎癌細(xì)胞中NCOA5表達(dá)的差異。

2、　　(2)用免疫組化檢測臨床腎癌組織標(biāo)本中NCOA5的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析NCOA5表達(dá)與臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系。
　　(3)通過含有NCOA5基因的慢病毒及空載體慢病毒感染腎癌細(xì)胞ACHN和OS-RC-2，流式細(xì)胞儀分選并建立高表達(dá)NCOA5的腎癌穩(wěn)定株。
　　(4)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染NCOA5基因前后，腎癌細(xì)胞株中NCOA5蛋白的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析是否有差異。
　　(5)用CCK-8法、細(xì)胞劃痕及Transwel

3、l實(shí)驗(yàn)分別檢測轉(zhuǎn)染NCOA5對(duì)腎癌細(xì)胞的生長增殖、細(xì)胞侵襲及遷移等影響。
　　結(jié)果：
　　(1) Western blot結(jié)果顯示293、HK2、ACHN、OS-RC-2細(xì)胞中NCOA5的相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.02、0.34±0.01、0.11±0.02、0.04±0.02，293細(xì)胞株中NCOA5的表達(dá)量最高，OS-RC-2中NCOA5表達(dá)量最低，而腎癌細(xì)胞株中NCOA5的表達(dá)水平低于腎上皮細(xì)胞中的表達(dá)。
　

4、　(2)免疫組化結(jié)果顯示14例腎癌病例中NCOA5陽性表達(dá)9例，陽性率為64.3％，癌旁組織中NCOA5均為陽性表達(dá)（x2=6.087、P=0.041＜0.05），表明NCOA5在腎癌中的表達(dá)低于癌旁組織。分析顯示腎癌組織中NCOA5的表達(dá)高低還與患者年齡、腫瘤最大直徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期情況、核分化等級(jí)顯著相關(guān)（x2=7.778、10.370、5.833、5.833、7.778，p=0.021、0.003、0.031、0.031

5、、0.021均＜0.05）。而與患者性別、病理類型、腫瘤部位無顯著相關(guān)（x2=4.321、2.121、0.026，p=0.086、0.258、1.000均＞0.05）。在年齡大、腫瘤直徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高臨床分期、高的核分化等級(jí)的病例中，NCOA5的表達(dá)相對(duì)較低。
　　(3)轉(zhuǎn)染NCOA5后ACHN、OS-RC-2細(xì)胞傳代時(shí)間延長，并導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡；而空載體慢病毒轉(zhuǎn)染后傳代時(shí)間無明顯變化，未出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。在換用更高培養(yǎng)條件

6、的DMEM培養(yǎng)基后，并經(jīng)大量細(xì)胞流式分選，最終建立了高表達(dá)NCOA5的ACHN腎癌穩(wěn)定株，OS-RC-2細(xì)胞因轉(zhuǎn)染NCOA5后大量細(xì)胞死亡，未能建立相應(yīng)的穩(wěn)定株。
　　(4) Western Blot檢測顯示ACHN、NC-ACHN、NCOA5-ACHN細(xì)胞中NCOA5的相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.06、0.16±0.01、0.81±0.03。NCOA5-ACHN組中NCOA5表達(dá)含量相對(duì)高于ACHN、NC-ACHN組中NCOA

7、5表達(dá)含量（P<0.05）。
　　(5) CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測得到ACHN、NC-ACHN、NCOA5-ACHN組與對(duì)照組吸光度的差值，在24 h分別為0.32±0.04、0.31±0.03、0.21±0.02；48 h分別為0.54±0.10、0.58±0.07、0.34±0.03；72 h分別為1.10±0.14、1.04±0.11、0.63±0.16；與ACHN組相比較，NCOA5-ACHN組細(xì)胞的增殖能力明顯減弱（P<0.0

8、5），NC-ACHN組無明顯變化（P＞0.05），表明過表達(dá)NCOA5后細(xì)胞增殖能力下降（P<0.05）。
　　(6)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)24小時(shí)ACHN、NC-ACHN、NCOA5-ACHN各組細(xì)胞邊界間距離變化分別為：0.820±0.017、0.785±0.031、0.482±0.015，經(jīng)檢驗(yàn)ACHN、NC-ACHN組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），NCOA5-ACHN組與其它兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），NCOA5-ACH

9、N組細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯降低。
　　(7)利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示ACHN、NC-ACHN、NCOA5-ACHN組穿膜細(xì)胞數(shù)分別是410±14、418±16、107±9，經(jīng)分析ACHN、NC-ACHN組穿膜細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而NCOA5-ACHN組穿膜細(xì)胞數(shù)與其它兩組均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），可見在腎癌細(xì)胞株ACHN過表達(dá)NCOA5后細(xì)胞的侵襲力明顯降低。
　　結(jié)論：
　　(1

10、)本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測證明NCOA5在人腎上皮細(xì)胞293、HK2中的表達(dá)要明顯高于人腎癌細(xì)胞ACHN、OS-RC-2，且不同的上皮細(xì)胞和腎癌細(xì)胞之間的表達(dá)量均存在差異。
　　(2)免疫組化分析人腎癌組織中NCOA5的相對(duì)表達(dá)比癌旁組織要低，且NCOA5的表達(dá)量與與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、臨床分期、核分化等級(jí)有關(guān)。
　　(3)本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒感染NCOA5基因，建立了穩(wěn)定表達(dá)NCOA5的ACHN細(xì)