MicroRNA靶向單核巨噬細(xì)胞MAPK-NF-κB通路相關(guān)基因在新生隱球菌致病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究以miRNA靶向單核巨噬細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）MAPK/NF-κB通路相關(guān)基因在新生隱球菌致病中的作用及機(jī)制為研究內(nèi)容，探討miRNA靶向相關(guān)基因在新生隱球菌致病的相關(guān)作用機(jī)制。首先我們進(jìn)行新生隱球菌(WN148)誘導(dǎo)人源單核巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)篩選及靶基因生物信息學(xué)分析;觀察miR-146a、miR-30b在THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)組、健康人原代單核細(xì)胞組、“免疫活性正?！彪[腦患者單核細(xì)胞組的表達(dá)規(guī)律;觀察新生隱

2、球菌誘導(dǎo)后THP-1的miR-146a的誘導(dǎo)表達(dá)以及檢測miR-146a對MAPK/NF-κB表達(dá)的影響;分析miR-146a靶向IRAK1和TRAF6在新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1中免疫調(diào)控作用及可能的機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究新生隱球菌在機(jī)體內(nèi)的免疫作用機(jī)制提供基礎(chǔ)的理論研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　第一部分 新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中MicroRNA的差異表達(dá)及靶基因生物信息學(xué)分析
　　我們篩選新生隱球菌(WN148)誘導(dǎo)單核

3、巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞后差異表達(dá)的miRNA，并對這些miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測和相關(guān)生物學(xué)信息分析。WN148誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞0h、6h（分別代表對照組、干預(yù)組）后，收集細(xì)胞（每組n=4）。提取細(xì)胞總RNA電泳跑膠，回收12bp和30bp之間的小分子RNA，Illumina Hiseq2500進(jìn)行深度測序分析。同時進(jìn)行差異miRNA的驗(yàn)證:收集各組細(xì)胞，提取總RNA;采用Takara公司PrimeScriptTMRT reagent

4、 Kit特異miRNA的莖環(huán)引物進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn);采用SYBR(⑧)Premix Ex TaqTMⅡ檢測試劑盒，在ABI7900定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測。選取使用U6作為內(nèi)參照，miRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt計算。通過miRWalk中的Validated targets方式獲得miRNA的Target gene;將獲得的預(yù)測的Target基因列表進(jìn)行通過DAVID進(jìn)行GO(gene ontology，GO)富集分析基因功能的改變

5、，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)生物通路分析基因編碼的蛋白間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果表明miR-4792，miR-30b-5p（miR-30b），miR-30c-5p，miR-223-3p，miR-15b-3p，miR-146a-5p（miR-146a），miR-155-5p的表達(dá)上調(diào)，定量RT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果與Illumina測序結(jié)果一致。這些miRNA與免疫

6、相關(guān)靶基因主要富集于細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞器代謝、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、核酸活性調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能上。其生物信息學(xué)通路顯著富集于Cancer信號通路、MAPK信號通路、胞內(nèi)因子相互作用、T細(xì)胞信號通路、Toll樣受體調(diào)節(jié)、分子趨化黏附等通路。通過差異表達(dá)的miRNA篩選以及其靶基因生物信息學(xué)，并對miRNA參與免疫調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行研究，為下一步新生隱球菌發(fā)病機(jī)制的研究提供生物信息學(xué)指導(dǎo)和研究方向。
　　第二部分 差異表達(dá)mi

7、R-146a、miR-30b在各組細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律研究
　　我們選取miR-146a、miR-30b作為研究對象，分別觀察他們在新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)組、健康人原代單核細(xì)胞組、“免疫活性正?！彪[腦患者單核細(xì)胞組的表達(dá)規(guī)律。新生隱球菌誘導(dǎo)組，按照數(shù)量之比為5∶1比例將滅活隱球菌WN148與THP-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)0h、3h、6h、9h、12h后，離心收集細(xì)胞沉淀;原代人單核細(xì)胞分離及純化:從第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚科和醫(yī)學(xué)真

8、菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獲取隱球菌腦膜炎患者、健康人外周血樣本，利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離原代人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，利用抗-CD14微珠(BD Bioscience公司)從PBMC中純化單核細(xì)胞。收集各組細(xì)胞，提取總RNA，特異miRNA的莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。在ABI7900定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測，從而觀察各組細(xì)胞miR-146a、miR-30b的表達(dá)規(guī)律。
　　我們的研究顯示在新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞組m

9、iR-146a、miR-30b的表達(dá)從0h開始增加，并在不同時間點(diǎn)達(dá)到表達(dá)峰值。miR-146a同miR-30b相比，在THP-1細(xì)胞基礎(chǔ)水平要低，在新生隱球菌誘導(dǎo)下，THP-1細(xì)胞生產(chǎn)的miR-146a的比miR-30b上升更快，在3h達(dá)到峰值。同時，在原代單核細(xì)胞組，隱腦患者組miR-146a、miR-30b的表達(dá)相對于健康組中比較紊亂。
　　第三部分 miR-146a在新生隱球菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)規(guī)律的研究
　　我們首先

10、建立了新生隱球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞模型，觀察了新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平變化;根據(jù)前面生物信息分析的結(jié)果，觀察了參與miR-146a表達(dá)的有密切關(guān)系MAPK/N F-κB信號通路。我們用滅活隱球菌WN148與THP-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)0h、3h、6h、9h、12h后，離心收集上清液和細(xì)胞沉淀，檢測miR-146a對MAPK信號通路NF-κB基因及炎癥因子TNF-a、IL-1β表達(dá)的影響;使用PDTC（NF-κB抑制劑）

11、干預(yù)THP-1細(xì)胞12h后，再進(jìn)行滅活隱球菌WN148的誘導(dǎo)，進(jìn)一步觀測miR-146a對NF-κB基因及炎癥因子TNF-a、IL-1β表達(dá)的影響。為研究miR-146a對mir-146a-NF-κB軸的調(diào)控機(jī)制，我們用miR-146a mimics和miR-146a inhibitor轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞6h時后，新生隱球菌誘導(dǎo)誘導(dǎo)3h，再進(jìn)行相關(guān)的觀察指標(biāo)的研究。
　　結(jié)果顯示，miR-146a的表達(dá)在隱球菌誘導(dǎo)3h達(dá)到高峰，然

12、后逐漸從3h到12h減少。同時，NF-κB蛋白水平的表達(dá)是不斷增加，TNF-a、IL-1β表達(dá)的水平在不斷增加;使用NF-κB抑制劑處理后，TNF-a、IL-1β的表達(dá)較未干預(yù)組減少，同時miR-146a的表達(dá)在隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中受到抑制。結(jié)果提示miR-146a的表達(dá)水平在新生隱球菌誘導(dǎo)早期顯著增加，與炎性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。miR-146a表達(dá)依賴于NF-κB信號通路調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a m

13、imics和miR-146a inhibitor，miR-146a mimics組p65（NF-κB蛋白主要組分）表達(dá)顯著減弱，miR-146a inhibitor組，p65的表達(dá)升高，這意味著其可以顯著調(diào)節(jié)NF-κB新生隱球菌引起的激活。兩組在基因表達(dá)水平變化同一時間組變化不明顯;miR-146a通過miR-146a mimics和miR-146a inhibitor轉(zhuǎn)染影響NF-κB的表達(dá)，從而進(jìn)一步影響TNF-a和IL-1β的釋放

14、。這些數(shù)據(jù)表明miR-146a通過對MAPK/NF-κB途徑發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)而影響免疫反應(yīng)的狀態(tài)和強(qiáng)度。
　　第四部分 miR-146a靶向作用于IRAK1和TRAF6調(diào)控MAPK通路相關(guān)基因的機(jī)制研究
　　miRNA通過與靶基因3'UTR互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能，我們通過TargetScan及Miranda等數(shù)據(jù)庫對miR-146a的靶基因進(jìn)行了分析和預(yù)測，并結(jié)合文獻(xiàn)報道選取miR-146a的前期試驗(yàn)預(yù)測的靶基因IRAK

15、1和TRAF6的mRNA作為新生隱球菌發(fā)病機(jī)制研究對象。已有的miRNA生物信息學(xué)預(yù)測顯示，IRAK1和TRAF6的3'UTR包含有與miR-146a堿基配對的序列，我們構(gòu)建了螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體載體進(jìn)行研究，以海腎熒光素酶作為參照。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，檢測過表達(dá)或沉默miR-146a后對熒光素酶活力的影響;此外，通過熒光定量RT-qPCR、免疫印跡Western blot的方法檢測IRAK1和TRAF6基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

16、
　　我們測量發(fā)現(xiàn)miR-146a可顯著抑制報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，表明miR-146a靶向作用IRAK1和TRAF6基因。 miR-146a mimics組，IRAK1和TRAF6的mRNA的表達(dá)影響不明顯;IRAK1和TRAF6蛋白均顯著低于miR-146a mimics對照組。轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor組，IRAK1和TRAF6的mRNA的表達(dá)影響不明顯;IRAK1和TRAF6蛋白均顯著高于miR-146a

17、 inhibitor對照組。我們研究表明，IRAK1和TRAF6表達(dá)受到miR-146a轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，IRAK1和TRAF6 mRNA的表達(dá)量變化不明顯，IRAK1和TRAF6蛋白質(zhì)的表達(dá)受到明顯調(diào)控。
　　綜合以上研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a在新生隱球菌刺激單核巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用，MAPK/NF-κB通路炎癥性細(xì)胞因子的釋放;miR-146a通過針對IRAK1和TRAF6的負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制MAPK/NF-κB在