microRNA-155靶向SOCS1基因在新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用.pdf

1、目的：新生隱球菌是一種臨床上主要導(dǎo)致免疫抑制患者產(chǎn)生隱球菌病的重要致病真菌。新生隱球菌的典型感染途徑為把干燥的擔(dān)孢子或酵母吸入肺泡中，在免疫正常人則引起輕微感染或無(wú)癥狀感染。此外新生隱球菌有顯著嗜神經(jīng)性，其可傳播至中樞神經(jīng)引起可威脅生命的隱球菌性腦膜腦炎，因此，肺內(nèi)吞噬細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞，在決定能否阻止新生隱球菌傳播到中樞，是否引起威脅生命的腦膜腦炎的過(guò)程中起重要作用。
　　microRNA(miRNA)是由19-24個(gè)核苷酸組

2、成的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)著多個(gè)靶基因的表達(dá)。其中miR-155在炎癥和腫瘤方面均參與調(diào)節(jié)作用。它由眾多的炎癥介質(zhì)比如TNF-a和脂多糖等通過(guò)固有免疫調(diào)節(jié)。miR-155在多種被激活的免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，包括在決定新生隱球菌能否傳播到中樞的肺泡巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)，及其他的免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及DC細(xì)胞，已知的miR-155的眾多靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括促凋亡和抑炎蛋白，如Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白，IkB激酶和SOCS1。

3、>　　細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子包括CIS及SOCS1-7，是一類(lèi)免疫抑制分子家族，它們均由細(xì)胞產(chǎn)生并能夠反饋性地阻斷細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子，在多種人體炎性疾病過(guò)程中均有參與調(diào)控。其中SOCS1,又名SSI-1(STAT-induced STAT inhibitor-1)，其可由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生，又可反過(guò)來(lái)抑制眾多促炎癥因子如TNF-α，IL-6，IFN-γ等，是JAK/STAT通路上重要的負(fù)性調(diào)節(jié)

4、因素。
　　既往的研究發(fā)現(xiàn)在脂多糖以及病毒誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，均可觀測(cè)到miR-155的上調(diào)，并且能觀測(cè)到抑制其靶基因SOCS1。在我們所關(guān)注的新生隱球菌感染的炎癥反應(yīng)中，miR-155是否影響SOCS1，是否影響炎癥因子如TNF-α，IL-6的調(diào)節(jié)仍不明確，因此在本研究中，我們用熱滅活的新生隱球菌刺激單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，觀察miR-155靶向SOCS1的表達(dá)變化及調(diào)控規(guī)律，分析在新生隱球菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中是否也存

5、在miR-155靶向SOCS1的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，探索其是否也在隱球菌病的發(fā)病機(jī)制中承擔(dān)一定的作用。
　　第一部分 新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的檢測(cè)
　　方法：為了明確在新生隱球菌刺激下的巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-155水平是否對(duì)炎癥因子有影響，我們用新生隱球菌（標(biāo)準(zhǔn)株WM148）與巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞系）共孵育，分別在第0、3、6、9、12小時(shí)后收集細(xì)胞及其上清液，通過(guò)實(shí)時(shí)熒

6、光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)巨噬細(xì)胞miR-155，使用ELISA法檢測(cè)上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)量，并觀察其變化規(guī)律。
　　結(jié)果:在新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育0、3、6、9、12小時(shí)后，測(cè)得miR-155的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，而同時(shí)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)量呈時(shí)間依賴表達(dá)增加，然而后期增幅并不明顯。
　　第二部分 新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SOCS1基因和蛋白層面表達(dá)的檢測(cè)

7、　　方法：miR-155重要的靶基因?yàn)镾OCS1，為了明確在新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中，是否SOCS1確實(shí)有調(diào)控作用，我們使新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育，分別在第0、3、6、9、12小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞SOCS1的基因表達(dá)量，Western blot檢測(cè)SOCS1蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育0、3、6、9、12小時(shí)后，SOCS1基因表達(dá)量增加明顯(P＜0.05)，但SOCS1蛋白

8、表達(dá)不明顯。
　　第三部分 通過(guò)轉(zhuǎn)染抑制巨噬細(xì)胞miR-155后SOCS1表達(dá)的影響
　　方法：為進(jìn)一步探討在新生隱球菌作用下巨噬細(xì)胞中miR-155對(duì)其靶基因SOCS1的影響，我們給RAW264.7細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-155的siRNA以抑制miR-155表達(dá)后，再一次新生隱球菌共孵育誘導(dǎo)，時(shí)間設(shè)定分別為第0、3、9小時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞SOCS1的表達(dá)量，Western blot檢測(cè)SOCS1蛋白的表達(dá)量

9、。
　　結(jié)果:抑制miR-155表達(dá)后的巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共孵育誘導(dǎo)測(cè)得在第3、9小時(shí)SOCS1的基因和SOCS1蛋白的表達(dá)都有顯著增加，同抑制miR-155表達(dá)后共孵育0小時(shí)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：我們研究結(jié)果顯示新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，會(huì)刺激炎癥因子如TNF-α、IL-6等的釋放，并會(huì)觸發(fā)機(jī)體一系列的負(fù)反饋機(jī)制的激活。在炎癥因子的刺激下SOCS1基因的表達(dá)已被激活，但我們觀察到SOCS1蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯的增加

10、，表明在某些信號(hào)通路上有抑制SOCS1激活基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制的存在。正是由于這種機(jī)制的存在，有效避免了在炎癥表達(dá)的初期，負(fù)反饋機(jī)制過(guò)度的抑制抗炎因子產(chǎn)生，而不能發(fā)揮正常適度的巨噬細(xì)胞抵抗病原菌的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑制miR-155的基因表達(dá)，觀察miR-155對(duì)靶基因SOCS1的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后，抑制miR-155的表達(dá)，在新生隱球菌誘導(dǎo)3h、9h后，SOCS1基因的表達(dá)增加，同時(shí)SOCS1蛋白有相應(yīng)的增加，結(jié)果表

11、明miR-155表達(dá)抑制以后，部分解除對(duì)SOCSI基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制。說(shuō)明miR-155對(duì)SOCS1確實(shí)存在一定程度的抑制作用。
　　綜上所述，我們實(shí)驗(yàn)表明在新生隱球菌被吸入肺泡后在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的早期，在炎癥因子TNF-a、IL-6的誘導(dǎo)下，SOCS-1產(chǎn)生并對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)，以調(diào)控適度的免疫反應(yīng)。而SOCS-1是miR-155的靶基因之一，本研究表明，在新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中，SOCS1