中國李果實(shí)軟化相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、果實(shí)軟化是果實(shí)成熟過程中伴隨的重要現(xiàn)象，它直接影響果實(shí)的品質(zhì)和商品性能，也是果實(shí)采收和貯藏過程中品質(zhì)評(píng)估的重要指標(biāo)，從分子生物學(xué)的角度研究果實(shí)軟化機(jī)理有重要意義。本研究從中國李中克隆了與果實(shí)軟化相關(guān)的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、β-甘露聚糖酶（β-mannanase）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase）和擴(kuò)展蛋白（Expansins）基因的cDNA序列，并分別研究了果實(shí)貯藏過

2、程中基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。
　　 1.中國李果肉組織總RNA的提取
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了不同濃度的山梨醇洗液對(duì)李果肉組織中RNA提取效果的影響，經(jīng)分析表明：中國李果肉組織研磨后用山梨醇洗液處理有利于總RNA的提取，而不添加山梨醇的洗液，提取液中檢測(cè)不到RNA，當(dāng)洗液中山梨醇濃度為1.10mol/L時(shí)，中國李果肉組織總RNA的產(chǎn)率明顯高于0.35mol/L和3.00mol/L；以不同貯藏天數(shù)的中國李果實(shí)為試材提取總RN

3、A，其結(jié)果是一致的；通過RT-PCR擴(kuò)增EF-2基因，說明本實(shí)驗(yàn)提取的總RNA可以用于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。
　　 2中國李軟化基因的克隆及序列分析
　　 本文以中國李‘佛來索’為材料，根據(jù)NCBI上登錄的該基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得基因保守片段。再利用RACE技術(shù)從中國李果實(shí)中獲得了β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、β-甘露聚糖酶（β-galactosidase）、擴(kuò)展蛋白（Expa

4、nsins）基因全長(zhǎng)及α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofurano-sidase）基因cDNA的部分特異序列。
　　 中國李β-半乳糖苷酶基因登錄號(hào)為EU370208，命名為PsGAL，其cDNA的開放閱讀框?yàn)?511bp，編碼836個(gè)氨基酸，包括270bp的5’非翻譯區(qū)，推導(dǎo)蛋白分子量為92.34KD，等電點(diǎn)為7.86。疏水/親水性分析表明該基因所編碼的蛋白為親水性蛋白。同源比對(duì)結(jié)果表明中國李PsGAL基因所編

5、碼的氨基酸序列與桃（ABV32546）、蓖麻（EEF48062）、楊樹（XP＿002308268）、葡萄（CAO65358）、野生番茄（AAF21626）、芒果（ABN08398）、擬南芥（AAM13196）的同源性分別為98％、81％、80％、76％、73％、73％、71％。對(duì)編碼蛋白預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因含有β-半乳糖苷酶基因特有的Glyco＿h(yuǎn)ydro＿42和Gal＿lectin兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。
　　 中國李β-甘露聚糖酶基因登錄號(hào)為

6、EU345001，命名為PsMAN.PsMAN的cDNA全長(zhǎng)為1647bp，其中5’非翻譯區(qū)為112bp，3’非翻譯區(qū)為233bp，開放閱讀框?yàn)?302bp，編碼433個(gè)氨基酸。推導(dǎo)蛋白分子量為49.76KD，等電點(diǎn)為10.49。疏水性/親水性分析結(jié)果表明該基因所編碼的蛋白為親水性蛋白。PsMAN所編碼氨基酸同源性分析表明，中國李PsMAN與桃（ABV32548）、葡萄（XP＿002264115）、楊樹（XP＿002327685）、蓖麻

7、（EEF52605）、擬南芥（NP＿001145882）、水稻（EEC71222），玉米（NP_201447）的同源性分別為98％、82％、80％、68％、68％、66％、62％。對(duì)編碼蛋白預(yù)測(cè)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國李PsMAN含有Cellulase superfamily（glycosyl hydrolase family5）結(jié)構(gòu)功能域。
　　 中國李α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因cDNA部分序列登錄號(hào)為FJ601844，命名為Ps

8、AFA。PsAFA長(zhǎng)度為1254bp的序列，最大的ORF為933bp，編碼310個(gè)氨基酸。氨基酸同源比對(duì)結(jié)果表明，中國李PsAFA所編碼的氨基酸序列與桃（ABV32544）、蘋果（AAP97437）、沙梨（BAF42035）、草莓（ABV08816）、西洋梨（BAC99030）、擬南芥（BAD95302）的同源性分別為98％、84％、83％、82％、81％、70％。對(duì)所編碼的部分蛋白預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)中國李PsAFA含有一個(gè)Alpha-L-A

9、F＿C結(jié)構(gòu)功能域。
　　 中國李擴(kuò)展蛋白基因登錄號(hào)為EU340362，命名為PsEXP，其cDNA全長(zhǎng)序列為1344bp，其中5’非翻譯區(qū)為126bp，3’非翻譯區(qū)為459bp，開放閱讀框?yàn)?59bp，編碼252個(gè)氨基酸。該基因推導(dǎo)蛋白分子量為26.80KD，等電點(diǎn)為6.48。疏水性/親水性分析表明該基因所編碼的蛋白為親水性的蛋白。推導(dǎo)氨基酸序列同源比對(duì)表明中國李PsEXP與桃（BAB19676）、杏（AAC33530）、梅（B

10、AE48665）、酸櫻桃（AF159563）、棗（ACK432222）、棉花（ABB59694）、橙（ACN87961）的同源性分別為99％、98％、98％、98％、89％、88％、89％。對(duì)所編碼蛋白預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)中國李擴(kuò)展蛋白含有DPBB_1和Pollen＿allerg_1兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能域。
　　 3中國李果實(shí)軟化基因表達(dá)分析
　　 以‘蓋縣大李’為材料，研究了常溫、低溫和ABA處理對(duì)中國李貯藏過程中果實(shí)軟化相關(guān)基因（P