家貓血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因表達、突變體構(gòu)建及作為SARS-CoV受體的功能研究.pdf

1、2002年冬天至2003年，我國爆發(fā)嚴重急性呼吸綜合癥，并迅速傳播至全球二十多個國家，導致8000多人感染，將近10％感染者死亡，一種新的冠狀病毒（SARS-CoV）是這場疫情的元兇。SARS-CoV的傳播與動物有關。2003年，研究人員從果子貍中分離到了SARS病毒，全基因組序列與人類SARS病毒具有99％的同源性。最近研究又發(fā)現(xiàn)蝙蝠攜帶有類SAR-CoV，與人SARS-CoV基因組序列同源性達92％，不過這種病毒不會直接感染人類。野

2、生蝙蝠可能是非典病毒的源頭宿主，果子貍只不過是SARS-CoV變異傳播鏈上一個很重要的環(huán)節(jié)，作為SARS-CoV的中間宿主和重要載體將病毒從野外傳染到人類身上。家貓也是SARS-CoV的易感動物。2003年SARS大爆發(fā)期間，在香港陶大花園SARS患者家中的寵物貓血清中檢測到了SARS-CoV。SARS-CoV人工感染家貓、雪貂也獲得成功，病毒能夠在家貓體內(nèi)正常增殖，被感染的家貓能有規(guī)律排毒，出現(xiàn)與人類SARS-CoV感染類似的病理變化

3、，并可將病毒傳染給與其共同飼養(yǎng)的原本不帶毒的動物。 人的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是SARS-CoV的一個功能性受體，本實驗室首次克隆了家貓ACE2基因，為了深入探討家貓ACE2基因作為SARS-CoV受體及其在SARS傳播中的作用，本研究開展了如下工作： （1）家貓ACE2空間結(jié)構(gòu)建模：家貓ACE2基因編碼的氨基酸序列與人ACE2同源性達85％，本研究以人ACE2結(jié)構(gòu)為模板，用同源模建法建立了貓ACE2的三維空間結(jié)

4、構(gòu)模型，蛋白質(zhì)對接法模擬了貓ACE2分子與SARS-CoV S的RBD結(jié)合。所預測的三維結(jié)構(gòu)基本在一定程度上能反映出貓ACE2真實的空間構(gòu)象，預測得到的模型與人ACE2的空間結(jié)構(gòu)非常相似。比較ACE2分子中與SARS-CoV S蛋白受體結(jié)合區(qū)相接觸的18個氨基酸，家貓ACE2只有三個氨基酸與人ACE2不同，分別為L24Q、E38D與T82M，提示家貓ACE2可能為SARS-CoY的功能性受體。 （2）家貓ACE2原核表達及與SA

5、RS-CoV S1蛋白的結(jié)合：人ACE2的受體功能區(qū)位于N端，SARS-CoV的受體結(jié)合蛋白為其纖突蛋白S1蛋白。為了獲得家貓ACE2作為SARS-CoV受體的直接證據(jù)，本研究在大腸桿菌BL21（DE3）中表達了家貓ACE2 N端19aa-367aa，并純化得到重組蛋白。經(jīng)配體轉(zhuǎn)印試驗和ELISA均證實，重組的fACE2<,19～367>蛋白片段能夠與重組的SARS-CoV S1蛋白結(jié)合。 （3）貓ACE2基因的真核表達：為了深

6、入研究貓ACE2基因的受體活性，進一步構(gòu)建了基因片段的真核表達載體pcDNA-mfA367，間接免疫熒光檢測表明家貓ACE2 N端1aa-367aa在細胞膜上實現(xiàn)了定位表達。這為深入研究貓ACE2的SARS-CoV受體功能提供了重要工具。 （4）家貓ACE2突變體構(gòu)建：為了進一步研究家貓ACE2在SARS～CoV跨種感染中的地位，本研究進行了家貓ACE2系列突變體構(gòu)建。針對已報道的人ACE2決定SARS-CoV受體功能的關鍵氨基

7、酸，以pcDNA-mfA367為模板，用定點突變技術(shù)構(gòu)建了六個單位點突變體。在此基礎上，對突變體進行了真核表達，進一步用假病毒感染試驗、合胞體觀察實驗、免疫熒光等檢測了貓ACE2及其突變體與SARS-CoV之間的相互作用。 總之，本研究獲得貓ACE2作為SARS～CoV受體的生物信息學證據(jù)及直接的體外實驗證據(jù)。構(gòu)建了貓ACE2的原核與真核表達載體，獲得系列ACE2的系列突變體并進行了真核表達與功能分析。為進一步研究家貓ACE2在