香菇C91-3菌LP1-P13K樣蛋白的克隆表達(dá)、分離純化及其活性研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建高效快速且方便的His標(biāo)簽原核表達(dá)體系，對(duì)香菇C91-3菌自噬相關(guān)基因LP1-PI3K(Latcripin-1-PI3K)進(jìn)行克隆，將成功克隆的質(zhì)粒pET-32a-PI3K在E.coliRosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)該LP1-PI3K樣蛋白進(jìn)行分離、純化和復(fù)性。將純化復(fù)性后的目的蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞，通過對(duì)其生物學(xué)活性的檢測(cè)，初步分析其作用于腫瘤細(xì)胞的途徑和機(jī)制，為LP1-PI3K樣

2、蛋白更進(jìn)一步的生物學(xué)功能與作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步深入揭示香菇C91-3菌的抗腫瘤機(jī)制及生物抗腫瘤藥物的研究提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.根據(jù)GenBank: JQ327159.1中香菇C91-3菌相關(guān)蛋白LP1(Latcripin-1)的基因序列，分別設(shè)計(jì)特異性上下游引物，采用PCR方法，以LP1基因序列為模板，擴(kuò)增出LP1-PI3K基因結(jié)構(gòu)域序列。將LP1-PI3K基因克隆到pMD19-T SimpleVec

3、tor克隆載體中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選出陽性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及PCR驗(yàn)證后，進(jìn)行基因測(cè)序。再將純化回收后的LP1-PI3K基因克隆到pET-32a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta-gami(DE3)，提取質(zhì)粒，進(jìn)一步經(jīng)雙酶切和特異引物PCR進(jìn)行驗(yàn)證后，測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。
　　2.將鑒定正確的含目的基因的原核表達(dá)載體在E.coli Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。12％ S

4、DS-PAGE電泳鑒定蛋白的表達(dá)情況，并且用Western-blot進(jìn)行驗(yàn)證。采用親和層析的方法分離純化LP1-PI3K樣蛋白，并對(duì)該蛋白進(jìn)行尿素梯度復(fù)性，最后測(cè)定純化后LP1-PI3K樣蛋白濃度。
　　3.將已鑒定的各濃度的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞。用MTT(Methyl Thiazoly Ltetrazolium assay，MTT)法測(cè)定LP1-PI3K樣蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LP1-PI3K樣

5、蛋白對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡作用及對(duì)人肺癌A549細(xì)胞周期的影響;用電鏡法觀察LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;用Western-blot檢測(cè)自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3），根據(jù)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達(dá)的變化，分析LP1-PI3K樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的水平。
　　結(jié)果:
　　1.PCR擴(kuò)增出大小為747 bp的基因片段，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示與GenBank上LP1基因序列中

6、PI3K樣結(jié)構(gòu)域序列的同源性為100％，并成功構(gòu)建了pET-32a原核表達(dá)載體。
　　2.此結(jié)構(gòu)域蛋白在E.coli Rosetta-gami(DE3)中被大量誘導(dǎo)表達(dá)，12％SDS-PAGE電泳顯示，蛋白分子質(zhì)量大約為44 KDa(計(jì)算載體標(biāo)簽后的蛋白相對(duì)分子量)。誘導(dǎo)表達(dá)過程中，目的蛋白在加入誘導(dǎo)劑后開始表達(dá)，3小時(shí)效率最高。Western-blot結(jié)果顯示E.coli Rosetta-gami(DE3)所表達(dá)的蛋白為LP1-

7、PI3K樣蛋白。通過組氨酸標(biāo)簽親和層析分離和純化該蛋白，12％ SDS-PAGE顯示得到純化的LP1-PI3K樣蛋白。
　　3.對(duì)LP1-PI3K樣蛋白生物學(xué)活性的初步檢測(cè):①對(duì)于人肺癌A549細(xì)胞，LP1-PI3K樣蛋白作用濃度為分別為15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml，作用時(shí)間分別為24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。當(dāng)濃度為15μg/ml時(shí)抑瘤率分別為3.10％，8.22％，15.33％;當(dāng)濃度為30μg/ml時(shí)抑瘤率

8、分別為7.85％，14.36％，19.70％;當(dāng)濃度為60μg/ml時(shí)抑瘤率分別14.15％，29.49％，31.48％。MTT法檢測(cè)結(jié)果:隨著作用時(shí)間的延長和濃度的增加，抑瘤率逐漸增加。除15μg/ml的LP1-PI3K樣蛋白作用24小時(shí)與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組與對(duì)照組相比有顯著性差異口＜0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明LP1-PI3K樣蛋白對(duì)人肺癌A549細(xì)胞有顯著地抑制作用。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，LP1-PI3K樣蛋

9、白具有一定誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的能力，其作用可能與自噬相關(guān)。終濃度為30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml的此蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時(shí)后，最大早期細(xì)胞凋亡率為8.49％，18.58％，20.45％;最大晚期細(xì)胞凋亡率為5.01％，10.06％，14.88％。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組人肺癌A549細(xì)胞，在LP1-PI3K樣蛋白作用下各期細(xì)胞較空白對(duì)照組相比S期變化不大，G1期G2/M期雖有變化，但該變化沒有

10、呈現(xiàn)出規(guī)律性。此外在G1期峰前還出現(xiàn)凋亡峰，但該凋亡峰沒有表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。③透射電子顯微鏡顯示，60μg/ml LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時(shí)后，其形態(tài)學(xué)發(fā)生很大改變。對(duì)照組人肺癌A549細(xì)胞，膜相結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，線粒體豐富;目的蛋白作用組細(xì)胞:核染色質(zhì)固縮，核碎裂，胞漿內(nèi)空泡增多，出現(xiàn)凋亡小體，尤其在較大范圍細(xì)胞中出現(xiàn)了大量的自噬小體，自噬體的出現(xiàn)是LP1-PI3K樣蛋白作用于人肺癌A549的特

11、征現(xiàn)象。④Western-blot檢測(cè)LC3。在對(duì)照組中兩種LC3自噬標(biāo)記物:LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的數(shù)量均較低。而將LP1-PI3K樣蛋白60μg/ml作用于人肺癌A549細(xì)胞48小時(shí)后，從Western-blot的結(jié)果分析LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，且LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯高于LC3-Ⅰ，說明LP1-PI3K樣蛋白能誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功獲得了LP1-PI3

12、K樣結(jié)構(gòu)域序列，并成功構(gòu)建了pET-32a原核表達(dá)體系。
　　2.本實(shí)驗(yàn)成功在E.coli Rosetta-gami(DE3)宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)出LP1-PI3K樣蛋白;該蛋白經(jīng)組氨酸標(biāo)簽親和層析柱成功純化;尿素梯度復(fù)性成功。
　　3.LP1-PI3K樣蛋白生物學(xué)功能經(jīng)初步研究，其可抑制肺癌A549細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡，同時(shí)可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞自噬。LP1-PI3K樣蛋白可初步歸類為Ⅲ型PI3K，其誘導(dǎo)的