雞白痢沙門菌T3SS2及其效應蛋白CigR的致病與免疫作用.pdf

1、雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum，Salmonella Pullorum)，又稱雛沙門菌，是雞白痢(Pullorum disease)的病原，具有高度適應專一宿主的特點，能垂直傳播，可引起雛雞的急性敗血癥，多侵害3周齡以內(nèi)幼雛，發(fā)病率和死亡率極高;對日齡較大的青年雞也可致病和致死;成年雞亦可被感染，常導致母雞產(chǎn)蛋減少，生殖道畸形，體重下降，也導致孵化率和出雛率明顯下降，還可感染火雞，

2、偶能感染其它禽和鳥類，給許多國家的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的危害，并引起嚴重的經(jīng)濟損失。目前，免疫接種可作為防控沙門菌病的一種重要手段，相對于傳統(tǒng)的滅活疫苗，減毒活疫苗能提供更加高效的保護，且能誘導較高的細胞免疫反應。
　　沙門菌致病島(Samonella pathogenicity island，SPI)2是位于沙門菌基因組上的一個約40 kb的主要毒力基因簇，其編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)2(typeⅢ secretion system2，T3

3、SS2)可以分泌多種功能不同的效應蛋白，這些效應蛋白對沙門菌在宿主細胞內(nèi)的存活和增殖起著重要作用，為進一步引起全身性的感染提供必要條件。目前，已有30多個沙門菌T3SS2效應蛋白被鑒定，其中很多效應蛋白的功能并不單一，大部分與沙門菌的毒力密切相關，cigR是唯一一個缺失后可引起鼠傷寒沙門菌毒力上升的效應蛋白基因。另外，并非這些效應蛋白均存在于所有血清型的沙門菌中，這意味著有些效應蛋白基因在部分沙門菌中是缺失的，或者有些基因在一些沙門菌中

4、是以假基因的形式存在。目前，關于沙門菌毒力基因的研究已越來越深入，但主要模型還是集中在鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。雞白痢沙門菌具有其獨特的特征，但對于雞白痢沙門菌相關的研究還很少，尤其是在T3SS2及其效應蛋白方面。
　　本研究主要基于T3SS2及其效應蛋白CigR探討了其與雞白痢沙門菌致病性之間的關系，并初步評估了雞白痢沙門菌減毒株作為疫苗株防控該病的可行性，為從分子水平上探明雞白痢沙門菌與雞體的相互作用關系打下基礎，也為進一步研

5、究雞白痢沙門菌感染與致病機理及找到更好防控該病的方法提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。
　　1.雞白痢沙門菌致病島2缺失株的構建及其生物學特性
　　以雞白痢沙門菌菌株S06004為研究對象，采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構建了雞白痢沙門菌S06004株的致病島2（SPI2，約40kb）缺失株S06004△SPI2。然后測定了該缺失株的生長特性、生化特性、遺傳穩(wěn)定性和致病性等基本生物學特性，并與野生株進行比較。結果顯示，SPI2的缺失不

6、影響雞白痢沙門菌的生長特性;與野生株一樣，該缺失株均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，而不能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、側金花醇、乳糖、丙二酸鹽、尿素、L-阿拉伯糖和硫化氫等;且該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性;其對2日齡雛雞的LD50是野生株的252倍。表明SPI2在雞白痢沙門菌的致病過程中起著重要作用，SPI2的缺失引起雞白痢沙門菌毒力的顯著下降，這為進一步研究雞白痢沙門菌SPI2的功能及研發(fā)減毒疫苗奠定了

7、基礎。
　　2.雞白痢沙門菌致病島2缺失株對雛雞的免疫保護效力評估
　　分別通過口服和肌肉注射兩種免疫途徑評價雞白痢沙門菌致病島2缺失株S06004△SPI2對2日齡雛雞的免疫保護效力，其中，口服免疫劑量為2×108CFU/只，肌注免疫劑量為2×107CFU/只。體重變化及臨床表現(xiàn)結果顯示，兩種免疫途徑均不影響雛雞的生長性能，與對照組一樣，免疫后雛雞并未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，且該缺失株在雛雞體內(nèi)具有一定的定植能力;血清抗體水平

8、測定及外周血淋巴細胞增殖實驗結果顯示，兩種免疫途徑均能誘導雛雞產(chǎn)生較強的體液免疫應答和細胞免疫應答反應;在免疫后第10天，分別用雞白痢沙門菌菌株S06004和雞傷寒沙門菌菌株SG9對雛雞進行攻毒，并觀察其臨床癥狀，統(tǒng)計其死亡情況，結果顯示，在攻毒早期免疫組雞出現(xiàn)了暫時的和輕微的厭食、腹瀉及精神萎頓等癥狀，5天左右即可恢復，死亡率和發(fā)病率極低，而未免疫攻毒對照組的雞卻呈現(xiàn)高發(fā)病率和死亡率，臨床癥狀明顯。上述結果表明雞白痢沙門菌減毒株S06

9、004△SPI2對雛雞具有良好的保護效力，可以作為理想的疫苗候選株，同時為雞白痢沙門菌減毒疫苗的進一步研究提供了數(shù)據(jù)。
　　3.雞白痢沙門菌致病島2對T3SS2效應蛋白基因表達的影響
　　經(jīng)序列分析，在雞白痢沙門菌菌株S06004染色體上共有20個T3SS2效應蛋白基因，其中sifB、sspH2和steC是以假基因的形式存在。采用實時熒光定量PCR方法，通過相對定量分析(2-△△CT)來比較雞白痢沙門菌菌株S06004與其S

10、PI2缺失株S06004△SPI2在感染禽巨噬細胞HD112.5h、7.5h和15h時，這20個T3SS2效應蛋白基因mRNA表達水平與S06004感染該細胞1.5h時這些基因mRNA表達水平的差異。結果顯示，這20個效應蛋白基因包括假基因sifB、sspH2和steC在雞白痢沙門菌感染過程中均有不同程度的表達;SPI2的缺失對基因cigR、gtgA、slrP、sopD、sseK1、steB和steC的表達并沒有顯著的影響，對基因pip

11、B2、sifB、sopD2、sseJ、 sseL、sspH2和steD的表達在三個時間點均有顯著影響，而對基因pipB、steA和sifA的表達只在一個或兩個時間點有顯著影響;缺失株感染時未檢測到基因sseF、sseG和spiC的表達。表明雞白痢沙門SPI2顯著影響一些T3SS2效應蛋白基因的表達，而另一些效應蛋白基因的表達并不受SPI2影響;假基因sifB、sspH2和steC在雞白痢沙門菌的感染過程中也可進行轉(zhuǎn)錄;缺失株感染時基因s

12、seF、sseG和spiC未表達與其位于SPI2上有關。這有助于進一步揭示T3SS2及其效應蛋白在雞白痢沙門菌感染過程中的致病機制，也為深入研究其功能提供了重要線索。
　　4.雞白痢沙門菌中T3SS2效應蛋白基因分布研究
　　沙門菌T3SS2效應蛋白基因在不同的沙門菌菌株中存在一定的差異性。本研究采用PCR方法檢測了在1962年至2013年間從我國分離的237株雞白痢沙門菌中25個T3SS2效應蛋白基因的分布特征;同時，通過

13、序列比對分析了這25個基因在18株不同血清型沙門菌中的流行特征，它們的全基因組序列來自GenBank。PCR結果顯示，在這237株菌株中，基因cigR、pipB、pipB2、SlrP、SopD、sopD2、piC、sseF、sseG、SseJ、sseK1、sseL、steA、steB、SteC和steD均存在，gogB和SspH1均缺失，基因gtgA、tgE、SifA、sifB、sseI、sseK2和sspH2在這237株菌株中的檢出率

14、分別為99.6％、45.2％、98.7％、99.2％、5.9％、15.2％和97.5％;與1962年至1979年間相比，2000年至2013年間gtgE、sseI和sseK2的分布水平顯著降低。序列比對分析結果顯示，有15個基因(cigR、pipB、pipB2、sifA、sifB、slrP、sopD、sopD2、spiC、sseF、sseG、sseL、steA、steC和steD)在這18株不同血清型沙門菌菌株中均存在，sifB、sse

15、K1、sspH2和steC在一些菌株中是以假基因的形式存在。結果表明，gtgE、sseI和sseK2在這237株菌株中分布具有一定的年代規(guī)律性;大部分被檢測基因在雞白痢沙門菌中具有廣泛分布;一些基因在微進化過程中形成了假基因。這為進一步分析相關基因的流行特征提供了重要線索，也為更加深入地研究這些效應蛋白基因的功能及了解相關基因的進化提供了數(shù)據(jù)。
　　5.雞白痢沙門菌T3SS2效應蛋白CigR功能的初步解析
　　CigR既是一

16、個由沙門菌致病島3編碼的T3SS2效應蛋白，也是一個膜蛋白。本研究采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構建了雞白痢沙門菌株S06004的cigR基因缺失株S06004△cigR，初步解析了CigR的基本功能。結果顯示，cigR的缺失不影響雞白痢沙門菌的生長特性和生化特性，且該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，但能夠增強雞白痢沙門菌在禽巨噬細胞HD11和雞體內(nèi)的增殖和/或存活能力，顯著降低雞白痢沙門菌生物膜形成的能力;該缺失株對2日齡雛雞的LD50僅

17、是野生株的五分之一;另外，在雞白痢沙門菌感染HD11過程中，利用實時熒光定量PCR方法檢測結果顯示，cigR的缺失顯著影響CXCLI1、CXCLI2、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和iNOS的產(chǎn)生，而對IL-4、IL-18、NF-kB1、TGF-β4和TNF-α的產(chǎn)生并沒有顯著影響。表明cigR的缺失引起雞白痢沙門菌毒力的顯著升高，顯著降低其生物膜形成的能力，并且CigR能夠顯著影響一些細胞因子、趨化因子及其它免疫相關因子