選擇性捕獲雞白痢沙門菌在巨噬細胞內的轉錄序列.pdf

1、雞白痢沙門菌呈世界范圍分布。目前，在西方部分發(fā)達國家雞白痢已經被消滅或基本消滅，而在國內該病的危害仍嚴重。雞白痢沙門菌多造成2-3周齡雛雞死亡，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。感染后存活的雞常表現生殖系統病變，引起蛋雞產蛋量下降，并污染種蛋，造成巨大的經濟損失。該病既可垂直傳播，又可水平傳播，造成嚴重的危害。探究雞白痢沙門菌潛在的致病基因，了解其致病機理，對于尋求新的有效防治措施具有重要的意義。
　　 隨著各種分子生物學和免疫學研究

2、手段的出現，人們對病原體在感染宿主過程中轉錄基因序列的研究也逐漸深入。選擇性捕獲轉錄序列(selective capture oftranscribed sequences，SCOTS)技術在研究病原體體內轉錄序列方面有著獨特的優(yōu)勢。本研究比較了雞白痢沙門菌在雞體內和體外巨噬細胞系中的存活消亡趨勢，以雞巨噬細胞系HD-11為侵染模型，用SCOTS技術捕獲該菌在巨噬細胞中的轉錄序列，并初步分析了其中一個序列在侵染細胞過程中的轉錄水平。

3、r>　　 ⑴雞白痢沙門菌體內外侵染實驗。為了探究雞白痢沙門菌S06004在與雞體單核吞噬細胞系統和體外巨噬細胞系的相互作用的過程中，細菌定殖、復制的變化趨勢，進行了細菌的體內侵染實驗和體外巨噬細胞侵染實驗。體內侵染實驗中，以口服和肌注兩種方式感染9日齡非免疫海藍蛋雞，感染后第三天吞噬細胞中的細菌量都達到最高點，第九天下降到每克組織中帶菌量不足500 cfu，且這種狀態(tài)能夠持續(xù)至少5天。在體內侵染實驗中，細菌的定殖趨勢為先發(fā)生復制增殖、

4、后消減至很低水平，并且低水平的帶菌狀態(tài)會維持一段時間。同時在體外侵染實驗中，不論給予細菌1h還是2.5h的作用時間，進入巨噬細胞內的細菌量在增殖3h左右時都達到最高點，消減到較低的水平后，能夠維持一段時間。在體外實驗中胞內的細菌同樣具有先增殖后消減，并維持一段低水平細菌攜帶率的平臺期的存活趨勢。雞白痢沙門菌S06004株對雞巨噬細胞系HD-11的體外侵染實驗結果和體內吞噬細胞侵染實驗結果基本吻合，故采用雞白痢沙門菌侵染雞巨噬細胞系HD-

5、11可以在一定程度上模擬細菌體內感染時與內臟器官吞噬細胞系統的相互作用。
　　 ⑵選擇性捕獲雞白痢沙門菌在巨噬細胞內的轉錄序列。應用SCOTS方法鑒定雞白痢沙門菌S06004株在感染雞巨噬細胞系HD-11過程中細菌表達的基因。根據細菌體內和體外侵染實驗的研究結果，選用雞白痢沙門菌S06004侵染雞巨噬細胞系HD-11，以模擬細菌體內侵染吞噬細胞過程，通過SCOTS技術對轉錄序列cDNAs的選擇性捕獲，檢測了細菌在與巨噬細胞相互作

6、用過程中毒力基因以及相關調控基因的表達，共得到16個序列。除了一個未知序列，這些體內轉錄序列包括毒力相關的Ⅲ型分泌系統中分泌素蛋白和Ⅰ型分泌系統中外膜蛋白的編碼基因、代謝相關的敏感激酶和核苷水解酶的編碼基因、運輸功能基因、一些質粒編碼基因以及環(huán)境適應性功能基因等。
　　 ⑶實時熒光定量PCR動態(tài)分析雞白痢沙門菌體內轉錄序列7-6在侵染過程中的轉錄水平。根據SCOTS技術捕獲得到的體內轉錄序列7-6，設計了針對其特異性檢測的一對引