乳酸菌理化特性及其對雞白痢沙門氏菌的拮抗作用研究.pdf

1、畜禽抗生素的濫用對畜禽產品造成了藥物殘留和耐藥性菌株的污染等問題，嚴重危害了動物性食品的質量與安全，造成了嚴重的社會公共衛(wèi)生和食品安全。動物微生態(tài)制劑是綠色抗生素替代品之一，具有廣泛的應用價值。乳酸菌是研制動物微生態(tài)制劑的典型菌種，對動物腸道內環(huán)境微生態(tài)的穩(wěn)定具有調節(jié)作用，對宿主腸道疾病具有防治作用。雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴重的腸道細菌病之一，是重要的公共衛(wèi)生問題。防治S.pullorum

2、對雞的感染，對保障家禽健康養(yǎng)殖和動物性食品質量與安全具有重要的意義。
　　在乳酸菌屬中，乳酸桿菌是最主要的一類，其中包括干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobaeillus fermentum)、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等。L.fermentum天然存在腸道具有很強的胃腸道環(huán)境耐受力等優(yōu)點，有關其在預防和治療S.pullorum感染的報道較少。因此，本

3、研究旨在體外篩選出能抑制S.pullorum生長的乳酸菌株，以此為基礎，研究其體內外對S.pullorum的抗感染作用，進一步闡述乳酸菌對雞抗病原菌感染的保護性作用研究。具體研究內容和結果如下:
　　1.乳酸菌理化特性及抑菌活性比較
　　在本實驗室乳酸菌篩選的基礎上，選取L.casei1.2435、L.fermentum1.2133、L.acidophilus1.1854、S.thermophillus1.2471，4株乳酸

4、菌進行抑菌特性比較分析。通過耐酸性和膽鹽耐受實驗、細胞黏附實驗、疏水性實驗、抑菌實驗進行乳酸菌理化特性比較。實驗結果表明，4株乳酸菌在pH值2.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后，L.fermentum1.2133的存活率達到68％，顯著高于其他3株菌。在膽鹽濃度為0.3％的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后，L.fermentum1.2133存活率大于60％。表面疏水性實驗結果表明，各菌株間比較差異顯著，L.fermentum1.2133具有較高的表面疏水性;各

5、菌株對目標菌株均具有凝聚能力，其中L.fermentum1.2133自聚合能力最強。抑菌實驗結果表明，4株乳酸桿菌對病原菌E.coli AE17、E.coli O78以及S.pullorum CVCC533均具有一定的抑菌能力，且存在菌株差異性。L.fermentum1.2133對S.pullorum CVCC533有顯著的抑菌能力，L.acidophihus1.1854對E.coli AE17抑菌活性顯著，L.casei1.2435對

6、E.coli O78抑菌能力顯著，S.thermophillus1.2471抑菌活性較弱。
　　2.L.fermentum1.2133拮抗S.pullorum CVCC533體外抑菌作用觀察
　　采用熒光顯微鏡對L.fermentum1.2133發(fā)酵上清作用于S.pullorum CVCC533生物被膜中細菌的生存能力進行觀察，在L.fermentum1.2133發(fā)酵上清液與S.pullorumCVCC533共培養(yǎng)24h后，

7、顯微鏡中觀察到實驗組中S.pullorum CVCC533的生物被膜中S.pullorum CVCC533菌體大部分呈現紅色熒光，只有少量點狀的綠色熒光;對照組視野中基本為綠色熒光，僅有少量紅色熒光。在體外對L.fermentum1.2133與S.pullorum CVCC533進行競爭性共培實驗的結果表明，在0-18h，L.fermentum1.2133對S.pullorum CVCC533的生長抑制隨著時間的推移逐漸增強，S.pul

8、lorum的數量逐漸減少，到18h后，趨于穩(wěn)定。L.fermentum1.2133對S.pullorum CVCC533生長具有拮抗作用，且不同的初始菌液濃度形成的競爭性效果存在差異，菌液濃度10∶1的競爭性優(yōu)于1∶1。
　　3.L.fermentum1.2133對感染S.pullorum CVCC533的雞腸道菌群和組織病理學觀察
　　將120只1日齡的羅曼肉雞隨機分為4個組，分別為對照組（第Ⅰ組）、1日齡開始灌喂L.fe

9、rmentum1.2133（2.5×108cfu/chick）組（第Ⅱ組）、1日齡開始灌喂L.fermentum1.2133至14日齡攻毒S.pullorum CVCC533（5×108cfu/chick）的預處理組（第Ⅲ組）以及第14日齡直接感染S.pullorum CVCC533組（第Ⅳ組），分別進行腸道細菌計數和病理切片觀察。結果表明，雞感染后24h，回腸和盲腸細菌數均發(fā)生變化，第Ⅱ組乳酸菌數量顯著高于第Ⅲ組、第Ⅳ組，而沙門氏菌數

10、量明顯有所減少，好氧菌總數增多。第Ⅱ組雞的十二指腸、空腸、回腸腸狀態(tài)正常，腸絨毛完整，無明顯病理變化較第Ⅰ組雞小腸形態(tài)發(fā)育更完整;第Ⅲ組雞十二指可見腸絨毛固有層出現輕微腸炎性細胞侵潤;空腸絨毛中心軸有部分紅細胞，回腸絨毛表現局部損傷。第Ⅳ組十二指腸絨毛斷裂，絨毛自溶現象明顯，空腸絨毛中心軸紅細胞累積，回腸腸絨毛上皮的杯狀細胞被溶解，絨毛自溶現象明顯，第Ⅲ組與第Ⅳ組相比較，雞小腸各腸段的炎癥和出血點等癥狀減輕。
　　4.L.ferm

11、entum1.2133對感染S.pullorum CVCC533的雞腸道AvBD2mRNA轉錄水平的影響
　　本實驗采用RT-PCR方法，測定了L.fermentum1.2133對感染S.pullorumCVCC533的雞腸道AvBD2mRNA的轉錄水平。在雞感染72h內(0h，12h，24h，36、48h和72h)采雞小腸各段組織。結果表明，AvBD2在小腸各段中均有表達。在整個時間段內，第Ⅱ組AvBD2mRNA的轉錄水平在雞小

12、腸內的轉錄水平基本呈穩(wěn)定趨勢且轉錄水平顯著高于第Ⅰ組。第Ⅲ組和第Ⅳ組小腸段AvBD2mRNA的轉錄水平與第Ⅱ組差異顯著;第Ⅲ組在24h后，AvBD2mRNA的轉錄水平基本呈波動性變化趨勢降低，第Ⅳ組呈顯著性下降，都顯著低于第Ⅰ組轉錄水平，實驗結果表明，L.fermentum1.2133對雞腸道防御素AvBD2的表達具有調控作用。
　　上述研究表明，L.fermentum1.2133對雞腸道內環(huán)境具有很好耐受能力，且其發(fā)酵上清液對S