脊髓甘氨酸能前饋抑制回路LTD在神經(jīng)病理性痛覺超敏發(fā)生機(jī)制中的作用.pdf

1、疼痛閘門控制學(xué)說提出近50年以來一直影響著疼痛機(jī)制研究領(lǐng)域。然而它提出的閘門控制回路是以假說形式存在,其結(jié)構(gòu)和功能組成一直是未解之謎。本文作者所在課題組長期堅(jiān)持“閘門控制學(xué)說提出的回路是否存在”這一富有挑戰(zhàn)性的課題,最近對(duì)脊髓后角痛覺回路和觸覺回路之間的聯(lián)系回路的組成和可塑性變化進(jìn)行了深入研究,本課題組發(fā)現(xiàn)[1]后角III層內(nèi)接受非傷害性Ab纖維傳入的甘氨酸(Gly)能抑制性神經(jīng)元和IIi層的PKCg陽性興奮性中間神經(jīng)元之間存在著直接的

2、抑制性突觸聯(lián)系,形成一個(gè)前饋式抑制性回路;PKCg陽性中間神經(jīng)元與位于IIo層的接受痛覺傳入的興奮性中間神經(jīng)元(TC,中央細(xì)胞)形成興奮性突觸聯(lián)系,組成了粗纖維介導(dǎo)的非傷害性傳入調(diào)控細(xì)纖維介導(dǎo)的傷害性傳入的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這個(gè)甘氨酸能前饋抑制回路發(fā)揮著類似閘門的作用,控制觸覺信息向痛覺通路傳遞,而外周神經(jīng)損傷可引起這個(gè)前饋抑制回路功能降低形成閘門開放效應(yīng),使觸覺信息傳遞到痛覺通路產(chǎn)生痛覺超敏(allodynia)現(xiàn)象。
　　“痛覺超敏閘

3、門”是神經(jīng)病理性疼痛形成的重要機(jī)制之一。基于前期研究結(jié)果,本課題應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄、形態(tài)學(xué)和行為學(xué)技術(shù),對(duì)“痛覺超敏閘門”在外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛條件下的開放機(jī)制進(jìn)行了初步探索,本文提出AMPA受體內(nèi)吞介導(dǎo)的甘氨酸抑制回路 LTD可能是“痛覺超敏閘門”在外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛條件下的開放機(jī)制之一。
　　實(shí)驗(yàn)一:脊髓痛覺超敏閘門回路的突觸可塑性變化及機(jī)制研究
　　目的:應(yīng)用膜片鉗技術(shù),在正常大鼠脊髓切片上

4、研究脊髓痛覺超敏閘門回路的突觸可塑性變化及機(jī)制。
　　方法:取4～5周齡雄性SD大鼠脊髓腰膨大段制備帶后根的矢狀面切片。選擇脊髓后角Ⅱ?qū)雍廷髮咏唤缣幍纳窠?jīng)元做全細(xì)胞記錄,根據(jù)后根刺激反應(yīng)的潛伏期、誘發(fā)強(qiáng)度等電生理特征選擇需要的神經(jīng)元。通過高頻電刺激誘發(fā)長時(shí)程改變,觀察TAT-GluR2的作用。(1)觀察TAT-GluR2對(duì)高頻電刺激誘發(fā)的Ⅲ層甘氨酸能神經(jīng)元LTD的影響。(2)觀察TAT-GluR2對(duì)高頻電刺激誘發(fā)的Ⅱ?qū)覲KCγ神經(jīng)

5、元的長時(shí)程改變的影響。
　　結(jié)果:高頻刺激后,觸覺通路上的非傷害性Ad纖維與甘氨酸能神經(jīng)元形成的突觸產(chǎn)生的EPSP(Ab-EPSP)幅度明顯低于刺激前,且持續(xù)至少40min(n=6,P<0.001,one-way AVOVA);甘氨酸能神經(jīng)元與PKCg神經(jīng)元形成的抑制性突觸產(chǎn)生的IPSP(unitary IPSP)幅度明顯低于刺激前,且持續(xù)至少40min(n=6,P<0.001,one-way AVOVA)。預(yù)灌流Tat-GluR

6、220分鐘明顯抑制了甘氨酸能神經(jīng)元的EPSP-LTD和PKCg神經(jīng)元的IPSP-LTD的形成(n=6,P<0.001,one-way AVOVA)。TAT-GluR2S預(yù)處理對(duì)LTD的形成無明顯影響(n=5,P>0.05,one-way AVOVA)。
　　實(shí)驗(yàn)二: AMPA受體內(nèi)吞抑制劑TAT-GluR2對(duì)SNL大鼠痛覺超敏的影響
　　目的:用行為學(xué)方法探討TAT-GluR2對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的長時(shí)程改變的在體影響。

7、　　方法:建立大鼠SNL模型,蛛網(wǎng)膜下腔置管。通過在SNL之前和SNL引起神經(jīng)病理性疼痛之后鞘內(nèi)注射TAT-GluR2觀察局部阻斷AMPA受體內(nèi)吞對(duì)SNL引起的神經(jīng)病理性疼痛的預(yù)防和治療作用。
　　結(jié)果:(1)單次注射TAT-GluR2對(duì)假手術(shù)組動(dòng)物的痛閾沒有明顯影響(n=6,P>0.05,one-way AVOVA);對(duì)SNL動(dòng)物可以減緩機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值的下降速度(n=6,P<0.01,one-way AVOVA)。(2)持續(xù)

8、泵注TAT-GluR2顯著減緩SNL大鼠機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值的下降(n=6,P<0.01,one-way AVOVA)。(3)鞘內(nèi)注射TAT-GluR2對(duì)SNL后已經(jīng)形成的機(jī)械性痛敏仍有改善作用并且呈劑量依賴性(n=10,P<0.01,one-way AVOVA)。
　　實(shí)驗(yàn)三: SNL大鼠閘門回路中的GluR2和GlyRα3的定位分布變化
　　目的:觀察SNL大鼠GluR2和GlyRα3分布位置的改變
　　方法:SD大

9、鼠,雄性,180~220g,隨機(jī)分成兩組,一組造模,一組空白對(duì)照。造模組SNL后7天與空白對(duì)照同時(shí)取材,固定,冰凍切片,免疫熒光染色雙標(biāo)(PKCgand GluR2,PKCgand GlyRα3,GlyT2 and GluR2)。
　　結(jié)果:正常成年大鼠只有少數(shù)PKCγ陽性神經(jīng)元表達(dá)GluR2且主要分布在胞膜;SNL后PKCγ陽性神經(jīng)元上的GluR2發(fā)生內(nèi)吞。正常大鼠大多數(shù)PKCγ陽性神經(jīng)元表達(dá)GlyRα3且主要分布在胞膜;SNL

10、后PKCγ陽性神經(jīng)元上的GlyRα3分布無明顯變化。正常大鼠甘氨酸能神經(jīng)元的GluR2主要分布在胞膜;SNL后甘氨酸能神經(jīng)元膜上的GluR2發(fā)生內(nèi)吞。
　　小結(jié):
　　1.電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:觸覺通路甘氨酸神經(jīng)元和PKCg神經(jīng)元表達(dá)通路特異性LTD,甘氨酸能神經(jīng)元突觸后膜的谷氨酸受體內(nèi)吞可能是LTD形成的原因。這個(gè)抑制通路的LTD使甘氨酸神經(jīng)元抑制功能降低,進(jìn)而使PKCγ神經(jīng)元失去甘氨酸神經(jīng)元的控制,激活觸覺通路和痛覺通路之

11、間“沉默”的興奮性通路,觸覺信息由此傳入痛覺通路。
　　2.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:抑制AMPA受體內(nèi)吞可預(yù)防或改善外周神經(jīng)損傷引起的痛覺超敏的發(fā)生。
　　3.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:甘氨酸能神經(jīng)元膜上的GluR2內(nèi)吞可能是甘氨酸抑制性回路LTD及神經(jīng)損傷后痛覺超敏發(fā)生的主要原因之一,PKCγ陽性神經(jīng)元膜上的GlyRα3似乎與LTD的發(fā)生無關(guān)。
　　結(jié)論:AMPA受體內(nèi)吞介導(dǎo)的甘氨酸抑制回路LTD可能是“痛覺超敏閘門”在外周神