脊髓內(nèi)源性大麻素含量升高可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞并參與神經(jīng)病理性痛覺超敏的發(fā)生.pdf

1、生理狀態(tài)下，人們對(duì)能引起潛在組織損傷的刺激產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，這對(duì)維持機(jī)體完整、保證身體健康至關(guān)重要。但是，自發(fā)性疼痛或?qū)Σ磺‘?dāng)?shù)拇碳ぎa(chǎn)生持續(xù)性的疼痛（慢性疼痛）則會(huì)嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。據(jù)美國科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所報(bào)道，慢性疼痛的發(fā)病率已超過心血管疾病、糖尿病和癌癥的發(fā)病率，成為天下第一大病。作為最常見、最頑固、最難治的慢性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛因其高發(fā)病率、高致殘率已經(jīng)引起人們的密切關(guān)注。闡明神經(jīng)病理性疼痛神經(jīng)學(xué)機(jī)制以及尋求有效的治療手段，是當(dāng)

2、今醫(yī)學(xué)界亟待攻克的重大課題。
　　神經(jīng)病理性疼痛是以自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)、痛覺過敏(hyperagesia)及痛覺超敏（allodynia)為主要臨床特征[1]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system，ECS)主要由內(nèi)源性大麻素(endocannabinoids, eCBs)(如AEA、2-AG、OEA等)、作用受體(CB1、CB2、TRPV1等)以及大麻素代謝酶(FAAH、MAG

3、L等)組成[2]。以往研究多報(bào)導(dǎo)了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在痛覺通路中的鎮(zhèn)痛作用[3-6]，近年來的一些研究提示其可能通過抑制抑制性中間神經(jīng)元的功能而發(fā)揮致痛作用[7-10]。Starowicz and Przewlocka推測，神經(jīng)損傷后脊髓背角eCBs的含量升高，以某種形式促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[11]。
　　脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理性痛和癌癥痛等的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[12,13]。已證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞上存

4、在CB1受體，其可被神經(jīng)元釋放的eCBs激活，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸,進(jìn)而激活神經(jīng)元突觸外NMDA受體[14]。外源性大麻素（exogenous cannabinoids）也可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1受體，引起谷氨酸釋放[15]。
　　本研究擬運(yùn)用動(dòng)物行為學(xué)、免疫熒光染色等技術(shù)，探討脊髓內(nèi)源性大麻素含量升高是否會(huì)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞并參與神經(jīng)病理性痛覺超敏的形成，為進(jìn)一步研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分

5、：內(nèi)源性大麻素受體CB1與脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的共定位
　　目的：
　　觀察脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞上是否表達(dá)內(nèi)源性大麻素受體CB1。
　　方法：
　　選用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠4只，麻醉后先用PBS沖凈血液，隨即灌入多聚甲醛。取脊髓腰膨大段后固定、蔗糖梯度脫水、冰凍切片后，每只小鼠隨機(jī)挑取3片脊髓片行GFAP/CB1免疫熒光雙標(biāo)，觀察脊髓背角處二者的共標(biāo)情況。
　　結(jié)果：
　　脊髓背角處的星形

6、膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)內(nèi)源性大麻素受體CB1。
　　第二部分：升高鞘內(nèi)大麻素水平對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠機(jī)械性縮足閾值的影響
　　目的：
　　觀察鞘內(nèi)大麻素含量升高后實(shí)驗(yàn)大鼠疼痛行為的變化。
　　方法：
　　選用SD雄性大鼠36只，隨機(jī)分為2-AG組（n=6）、乙腈對(duì)照組（n=6）；CP55940組（n=6）、DMSO溶劑對(duì)照組（n=6）；JZL195組（n=6）、DMSO溶劑對(duì)照組（n=6）。全部行鞘內(nèi)置管術(shù)。利多卡因試驗(yàn)后取

7、造模成功動(dòng)物進(jìn)行鞘內(nèi)給藥。分別在給藥后第1、3、5、7、14、21 d測量實(shí)驗(yàn)大鼠機(jī)械性縮足反射閾值。
　　結(jié)果：
　　與各自溶劑對(duì)照組相比，鞘內(nèi)注射大麻素2-AG、大麻素受體激動(dòng)劑CP55940、大麻素水解酶抑制劑JZL195后可在第1 d產(chǎn)生明顯痛覺超敏（P＜0.01）并至少持續(xù)到給藥后第21 d（P＜0.001）。
　　第三部分：升高鞘內(nèi)大麻素水平對(duì)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：
　　觀察鞘內(nèi)

8、大麻素含量升高后，實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓背角處星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。
　　方法：
　　選用75只SD大鼠，隨機(jī)選取21只為2-AG實(shí)驗(yàn)組、21只為CP55940實(shí)驗(yàn)組、21只為JZL195實(shí)驗(yàn)組，剩余每組3只作為相應(yīng)的溶劑對(duì)照組。全部行鞘內(nèi)置管術(shù)，利多卡因試驗(yàn)后取造模成功動(dòng)物進(jìn)行鞘內(nèi)給藥。分別在給藥后第1、3、5、7、14、21 d取大鼠脊髓腰膨大，后固定、脫水、冰凍切片后，每組三只、每只大鼠隨機(jī)挑取3片脊髓片行GFAP免疫熒光單標(biāo)

9、，觀察脊髓背角處星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。
　　結(jié)果：
　　與各自溶劑對(duì)照組相比，鞘內(nèi)注射大麻素2-AG、大麻素受體激動(dòng)劑CP55940、大麻素水解酶抑制劑JZL195后可在第3 d開始激活星形膠質(zhì)細(xì)胞（P＜0.05）并至少持續(xù)到給藥后第21 d（P＜0.01）。
　　第四部分：敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1受體對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠疼痛行為及脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：
　　觀察敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1受體后，神

10、經(jīng)損傷后實(shí)驗(yàn)小鼠機(jī)械性縮足閾值的變化以及脊髓背角處星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。
　　方法：
　　選用雄性GFAP-CB1-KO小鼠、GFAP-CB1-WT小鼠各9只。隨機(jī)選出3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓，免疫熒光組織化學(xué)染色備用。剩余12只全部行坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)（CCI模型）。術(shù)后第7 d行為學(xué)檢測完后隨機(jī)抽取3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓，免疫熒光組織化學(xué)染色備用。術(shù)后第14 d行為學(xué)檢測完后剩余3只KO小鼠、3只WT小鼠

11、取脊髓，免疫熒光組織化學(xué)染色備用。
　　結(jié)果：
　　與WT+CCI小鼠相比，敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1受體的小鼠在神經(jīng)損傷后未形成明顯痛覺超敏（P＜0.001）；同時(shí)，其脊髓背角處星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活也明顯減少（P＜0.01）。
　　小結(jié)：
　　1.脊髓背角處的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)大麻素受體CB1。
　　2.升高鞘內(nèi)大麻素水平可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生痛覺超敏。
　　3.升高鞘內(nèi)大麻素水平可明顯激活脊髓背角處星形膠