人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧建立后盆神經(jīng)節(jié)電壓門控鈉通道研究.pdf

1、第一部分：正常盆神經(jīng)節(jié)膀胱支配神經(jīng)元的電壓門控鈉通道電生理特性研究 [目的]研究急性分離的成年大鼠盆神經(jīng)節(jié)(MPG)膀胱支配神經(jīng)元的電壓門控鈉通道(VGSCs)電生理特性，為排尿反射的機(jī)制研究奠定一定基礎(chǔ)。 [方法]采用熒光金(FG)對(duì)盆神經(jīng)中膀胱支配神經(jīng)元進(jìn)行逆行神經(jīng)追蹤標(biāo)記，然后采用全細(xì)胞膜片鉗方法對(duì)標(biāo)記神經(jīng)元VGSCs的穩(wěn)態(tài)激活，失活以及恢復(fù)動(dòng)力學(xué)等電生理特性進(jìn)行研究分析。 [結(jié)果]1.MPG中膀胱支配神經(jīng)

2、元其正常的神經(jīng)元為圓形或類圓形，直徑16～38μm，平均直徑24.28±3.28μm(n=46)。在鉗制電壓為-80mV時(shí)，其平均膜電容為24.05±3.31pF。 2.保持鉗制電壓為-80mV，且細(xì)胞外液中含鈉離子120mM時(shí)，MPG中膀胱支配神經(jīng)元VGSCs電流(INa)于-20mV時(shí)達(dá)到的最大電流密度，其平均電流密度為-165.13±13.51pA/F(n=29)，此電流能被1μMTTX完全阻斷，并具有可逆性。此INa穩(wěn)態(tài)

3、激活的閾電位平均為-33.79±1.82mV(n=29)，達(dá)到最大電流的膜電位約為-20mV(平均-19.65±0.78mV,n=29)，反轉(zhuǎn)電位(Vrev)約為+55mV。半激活電壓(V1/2)為-25.70±0.95mV，其斜率因子(Vc)為2.55±0.42mV。 3.MPG中膀胱支配神經(jīng)元INa的穩(wěn)態(tài)失活在去極化超過(guò)-80mV時(shí)出現(xiàn)，其半失活電壓(V1/2)為-39.92±0.79mV，斜率因子(Vc)6.93±0.46

4、mV(n=31)。 4.MPG中膀胱支配神經(jīng)元VGSCs的恢復(fù)時(shí)間常數(shù)為2.85±0.12ms(n=23)。 [結(jié)論]本研究驗(yàn)證了全細(xì)胞膜片鉗記錄聯(lián)合逆行神經(jīng)追蹤技術(shù)，對(duì)熒光標(biāo)記的自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的電生理特性進(jìn)行研究的可能性。電生理結(jié)果表明此類神經(jīng)元與交感和副交感神經(jīng)元均有一定差異，它具有自己特殊的電生理特性。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究MPG中膀胱神經(jīng)元的VGSCs在排尿反射過(guò)程中尤其是病理狀態(tài)下的的作用及調(diào)節(jié)可能性奠定了重要

5、的基礎(chǔ)。 第二部分：正常盆神經(jīng)神經(jīng)元電壓門控鈉通道亞型研究 [目的]研究急性分離的成年大鼠盆神經(jīng)節(jié)中的電壓門控性鈉通道的亞型分布，為進(jìn)一步闡明排尿反射機(jī)制的研究及相關(guān)臨床疾病的治療建立一定基礎(chǔ)。[方法]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及基因測(cè)序的方法對(duì)盆神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元鈉通道亞型分布進(jìn)行鑒定研究。 [結(jié)果]本研究結(jié)果顯示在MPG組織中未見(jiàn)Nav1.2，Nav1.3，Nav1.8，Nav1.9的表達(dá)，僅存在Nav

6、1.1，Nav1.6，Nav1.7的表達(dá)，且全部為TTX敏感性VGSCs。 [結(jié)論]MPG中存在的三個(gè)鈉通道亞型Nav1.1，Nav1.6，Nav1.7，可能參與了正常排尿反射，控制逼尿肌的運(yùn)動(dòng)功能。 第三部分：人工體神經(jīng)—內(nèi)臟神經(jīng)反射弧建立后盆節(jié)神經(jīng)元鈉通道 變化[目的]檢測(cè)人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧建立后的大鼠盆神經(jīng)節(jié)(MPG)膀胱支配神經(jīng)元的VGSCs電生理特性改變，為進(jìn)一步闡明該反射弧機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。

7、 [方法]采用熒光金(FG)逆行神經(jīng)追蹤和全細(xì)胞膜片鉗記錄方法對(duì)對(duì)照組、7天組利模型組中膀胱支配神經(jīng)元VGSC的電生理特性進(jìn)行研究，統(tǒng)計(jì)分析其差異性。 [結(jié)果]1.對(duì)照組、7天組利人工反射弧模型組的MPG膀胱支配神經(jīng)元，平均直徑24.58±2.08、25.87±1.38、24.07±1.42μm。在鉗制電壓為-80mV時(shí)，三組平均膜電容分別為25.21±0.47、26.12±0.43和23.90±0.47pF。與對(duì)照組相比

8、，統(tǒng)計(jì)未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。 2.對(duì)照組、7天組和人工反射弧模型組的MPG膀胱支配神經(jīng)元INa閾電位約分別為-33.79±1.82mV、-34.5±2.04mV，-34.78±2.50mV達(dá)到最大電流的膜電位分別為-19.65±0.78mV、-21.05±1.03mV、-19.13±0.87mV。其最大電流密度均值分別為-165.13±13.51pA/pF、-127.34±4.81pA/pF、-152.13±14.38

9、pA/pF。統(tǒng)計(jì)顯示7天組與對(duì)照組電流密度比較P＜0.01，模型組與對(duì)照組電流密度比較P＞0.05。三組達(dá)到最大電流幅值時(shí)的膜電位和閾電位之間未見(jiàn)顯著性差異。 3.對(duì)照組、7天組和模型組的半激活電壓(V1/2)分別為-25.70±0.95mV、-25.19±0.72mV，-24.29±0.68mV，曲線的斜率因子(Vc)分別為2.55±0.42mV，2.35±0.33mV，1.91±0.23mV。與對(duì)照組相比，半激活電壓和斜率因

10、子未見(jiàn)明顯差異。4.對(duì)照組、7天組和模型組MPG的VGSCs半失活電壓分別為-39.92±0.79mV，-37.06±0.82，-37.74±0.89mV，其斜率因子分別為6.93±0.46mV，6.55±0.72mV，6.86±0.78mV，三組間半失活電壓和斜率檢驗(yàn)未見(jiàn)顯著差異。 5.對(duì)照組、7天組和模型組VGSCs的恢復(fù)時(shí)間常數(shù)為3.06±0.83ms，3.10±0.53ms，3.17±0.49ms，三組間VGSCs的恢復(fù)

11、未見(jiàn)明顯差異。 [結(jié)論]研究結(jié)果從MPG的膀胱神經(jīng)元VGSCs功能的角度再次證實(shí)體神經(jīng)可以再生替代內(nèi)臟神經(jīng)。人工反射弧建立后MPG的電壓門控鈉離子通道動(dòng)力學(xué)特征的相對(duì)穩(wěn)定也是反射弧能發(fā)揮作用重要保證。納通道電流密度動(dòng)態(tài)變化與人工反射弧機(jī)制和神經(jīng)可塑性緊密相關(guān)。 第四部分：人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧建立后盆節(jié)鈉通道亞型半定量研究 [目的]通過(guò)VGSCs表達(dá)量上的變化研究，為深入闡明反射弧機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 [方

12、法]采用半定量PCR及圖像分析的方法測(cè)定盆神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元鈉通道各亞型在反射弧建立后不同時(shí)間段的MPG的VGSCs表達(dá)分布進(jìn)行鑒定研究。 [結(jié)果]對(duì)照組、7天組和模型組MPG中Nav1.1平均表達(dá)分別為0.7760±0.1030，0.4584±0.0335和0.7298±0.1156。而Nav1.6平均表達(dá)為0.7170±0.0697，0.7820±0.0663，0.7951±0.0810，Nav1.7平均表達(dá)為1.2780±0.1