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文檔簡介
1、本文研究了乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中HOXA5基因表達,探討其表達異常的發(fā)生機制及其臨床病理和治療意義。 方法 第一部分 1、采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction,Real-timeRT-PCR)技術(shù),檢測60例新鮮乳腺癌組織及24例良性乳腺病變中HOXA5mRNA表達。 2、分析HOXA5mRNA表達與
2、乳腺癌臨床病理資料間的相關(guān)性。 第二部分 1、甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR,MSP)法檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、SKBR3、MCF7中HOXA5基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài);Real-timeRT-PCR方法檢測上述3株細(xì)胞HOXA5mRNA表達。 2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮一2’-脫氧胞苷(5-aza-deoxycytidine,5-Aza-CdR)處理MD
3、A-MB-231細(xì)胞,Real-timeRT-PCR方法檢測藥物作用后HOXA5mRNA表達變化;MSP法檢測5-Aza-CdR處理后MDA-MB-231HOXA5基因甲基化狀態(tài)的變化,探討甲基化與乳腺癌HOXA5基因表達的關(guān)系。 3、半定量RT-PCR方法比較DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTlmRNA在MDA-MB-231、MCF7細(xì)胞中的表達量,初步探討HOXA5基因異常甲基化的發(fā)生機制。 4、甲基化特異性PCR法檢測60例
4、乳腺癌組織以及12例良性乳腺病變中HOXA5基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài),探討甲基化與HOXA5mRNA表達的關(guān)系以及與乳腺癌臨床病理資料間的相關(guān)性。 第三部分 1、免疫組化技術(shù)檢測乳腺癌及良性乳腺病變中HOXA5蛋白表達,研究HOXA5基因甲基化與蛋白表達的關(guān)系,初步探討其臨床病理意義。 2、免疫組化技術(shù)檢測孕激素受體(PR)蛋白表達,探討HOXA5蛋白表達與PR蛋白表達的關(guān)系 結(jié)果 第一部分
5、 1、HOXA5mRNA在乳腺癌中相對表達量0.73~193.07,均值為20.85,乳腺良性病變中相對表達量5.42~81.91,均值為30.94;乳腺癌HOXA5mRNA表達明顯低于乳腺良性病變(p=0.001)。 2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌HOXA5mRNA表達明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組,兩者間有顯著差異(p<0.05)。HOXA5mRNA表達與乳腺癌腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分型、浸潤性導(dǎo)管癌分級以及患者年齡未見相關(guān)
6、性(p>0.05)。 第二部分 l、MDA-MB-231、SKBR3HOXA5基因啟動子區(qū)CpG島是甲基化的,而MCF7呈未甲基化狀態(tài);甲基化的MDA-MB-231、SKBR3細(xì)胞HOXA5mRNA表達沉默,而未甲基化的MCF7細(xì)胞有HOXA5mRNA表達。 2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞重新表達HOXA5mRNA,HOXA5mRNA表達與5-Aza-CdR用量有時間和
7、劑量依賴關(guān)系。 3、5-Aza-CdR能使MDA-MB-231細(xì)胞部分去甲基化。5-Aza-CdR處理后MDA-MB-231HOXA5基因高甲基化狀態(tài)可得到部分逆轉(zhuǎn)。 4、MDA-MB-23l細(xì)胞DNMTlmRNA表達高于MCF7細(xì)胞(p<0.05)。 5、55例乳腺癌HOXA5基因啟動子區(qū)CpG島甲基化,甲基化陽性率為91.7%(55/60)。乳腺病和導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤HOXA5均為未甲基化狀態(tài)。3例纖維腺瘤中2例
8、呈部分甲基化,1例為未甲基化。乳腺癌和良性乳腺病變HOXA5基因甲基化陽性率有顯著差異(p<0.001),HOXA5基因甲基化具有腫瘤特異性。 6、HOXA5基因甲基化乳腺癌病例HOXA5mRNA表達比未甲基化病例低,兩者有顯著差異(p<0.05)。 7、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組乳腺癌HOXA5甲基化陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(p<0.05),HOXA5基因甲基化可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);HOXA5基因甲基化與患者年齡、腫瘤部位、
9、腫瘤大小、TNM分期以及乳腺癌病理分型無相關(guān)性(p>0.05)。 第三部分 1、HOXA5蛋白主要定位于細(xì)胞漿、可見于細(xì)胞膜,部分病例核旁胞漿HOXA5蛋白強染色。 2、正常乳腺上皮和肌上皮HOXA5蛋白均為強陽性染色。乳腺病、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤HOXA5蛋白強陽性表達,纖維腺瘤弱陽性表達。44例(44/46)乳腺癌HOXA5蛋白表達呈不同程度的減少或消失。 3、乳腺癌HOXA5基因甲基化與蛋白表達減少有相關(guān)
10、性(p=0.014)。 4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和陰性乳腺癌,HOXA5蛋白表達有顯著差異(p=0.001)。 HOXA5蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期、乳腺癌組織學(xué)分型等其它臨床病理學(xué)參數(shù)間未見統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。 5、此次實驗PR蛋白陽性率為43.5%;未顯示HOXA5和PR蛋白表達有相關(guān)性(p>0.05)。 結(jié)論 1、乳腺癌組織HOXA5mRNA表達明顯低于良性乳腺病變。HOXA
11、5mRNA表達減少可能與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231HOXA5mRNA表達抑制與該基因啟動子區(qū)CpG島過度甲基化有關(guān)。 3、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷能誘導(dǎo)MDA-MB-231重新表達HOXA5mRNA,5-氮-2’-脫氧胞苷可部分逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231HOXA5基因高甲基化狀態(tài)。 4、91.7%(55/60)乳腺癌組織中HOXA5基因啟動子區(qū)CpG島呈高甲基化狀
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