PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、此研究首次探討PEDF蛋白在乳腺癌中表達(dá)與乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系及其在乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用，與Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB這幾種蛋白質(zhì)的聯(lián)合檢測(cè)利于評(píng)估腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后，有助于對(duì)指導(dǎo)乳腺癌的治療和提高療效。觀察PEDF是否通過(guò)介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)參與乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，這一發(fā)現(xiàn)將為乳腺癌尋找新的治療藥物和作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分PEDF蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其與EMT

2、相關(guān)性研究
　　研究目的:
　　1.通過(guò)對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本中PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB表達(dá)研究，檢測(cè)PEDF基因是否參與了乳腺癌組織的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，并檢測(cè)與乳腺癌級(jí)別、組織臨床病理參數(shù)、分子分型的關(guān)系、闡明PEDF基因在乳腺癌EMT中的調(diào)節(jié)作用;
　　研究方法:
　　1.采用免疫組化方法檢測(cè)119例原發(fā)性乳腺癌組織和30例癌旁乳腺組織中PEDF基因、間質(zhì)

3、性標(biāo)記基因Vimentin、上皮性標(biāo)記基因E-cadherin、轉(zhuǎn)錄因子Snail及NF-κB蛋白的表達(dá)，比較乳腺癌組織和正常乳腺組織中這五個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況.
　　2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0(SPSS，Inc.Chicago，IL，USA)統(tǒng)計(jì)軟件,單因素和多因素分析PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail、NF-κB蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果:
　　1.PEDF、 E-cadherin、Vimentin、Snail及NF-κB蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為44.5％、49.5％、47.9％、57.1％;高表達(dá)的PEDF蛋白與低表達(dá)E-cadherin蛋白、高表達(dá)Snail蛋白、NF-κB蛋白有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，其中高表達(dá)的PEDF蛋白與低表達(dá)E-cadherin蛋白是中等相關(guān)，與高表達(dá)Snail蛋白、NF-κB蛋白是弱相關(guān)（P＜0.001，r=0

5、.496、r=0.34、F0.383）。
　　2.PEDF蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)（P=0.039）;而與患者年齡、TNM分期、組織學(xué)類型、ER受體、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P=0.809、P=0.240、P=0.113、P=0.862、P=0.137、P=0.555）。Vimentin蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、PR受體、組織學(xué)類型、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001

6、、P=0.017; P＜0.001、P=0.008、P=0.005)而與患者年齡、ER受體相關(guān)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.407、P=0.248)。E-cadherin蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、PR受體、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004、P＜0.001、P=0.014、P=0.013）;而與患者年齡、組織學(xué)類型、ER受體相關(guān)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.929、P=0.126、P=0.314);Snail蛋白高

7、表達(dá)與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001、P＜0.001、P=0.001），而與患者年齡、組織學(xué)類型、ER受體、PR受體相關(guān)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.775、P=0.672、P=0.348、P=0.111):NF-κB蛋白高表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期相關(guān)（P=0.001、P=0.001、P=0.001，P＜0.001），而與患者年齡、ER受體、PR受體相關(guān)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、=0.246、P=0.419、P=0.186)。
　　3.在119例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):高表達(dá)Vimentin、Snail and NF-κB與E-cadherin低表達(dá)成負(fù)相關(guān)(P＜0.001，r=-0.613，P＜0.001，r=-0.48，P＜0.001，r=-0.519)。Vimentin高表達(dá)與Snai核高表達(dá)、NF-κB高表達(dá)均稱成正相關(guān)（P＜0.001、r=0.428;P=0.002、

9、r=0.291）。此外，PEDF高表達(dá)與E-cadherin低表達(dá)成正相關(guān)(P＜0.001、r=0.496)，反而與Vimentin高表達(dá)、Snail高表達(dá)、NF-κB高表達(dá)成負(fù)相關(guān)(P＜0.001，r=-0.337; P＜0.001，r=0.34; P＜0.001，r=0.383)。
　　4.應(yīng)用Cox回歸模型單因素分析確認(rèn)PEDF、Vimentin、E-cadherin、Snail及NF-κB陽(yáng)性表達(dá)（P=0.006、P＜0.

10、001、P＜0.001、P=0.001、P＜0.001），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015)，腫瘤直徑(P=0.012)，病理分期（P=0.012）及PR受體情況（P=0.003）為矯正其因素后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;年齡、月經(jīng)狀況、組織學(xué)分級(jí)、ER狀態(tài)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析顯示Vimentin與E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)是總生存(OS;P=0.016，HR=0.429,95％CI:0.215-0.857及P=0.004，HR=3.274,95％

11、CI:1.476-7.262)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后影響因素，PEDF、腫瘤直徑是無(wú)疾病復(fù)發(fā)率(DFS)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后影響因素(DFS; P=0.034，HR=0.723，95％CI:0.361-1.446及P=0.042，HR=1.245,95％CI:1.008-1.537)。
　　第二部分干擾抑制PEDF蛋白表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　研究目的:
　　通過(guò)對(duì)乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞系的穩(wěn)定

12、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定干擾PEDF基因乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其增殖、侵襲和凋亡的影響來(lái)闡述PEDF基因在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的可能作用;
　　研究方法:
　　1.分別設(shè)計(jì)siRNA，干擾PEDF在乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞中表達(dá)(PEDF-siRNA);設(shè)計(jì)包裝慢病毒質(zhì)粒，在Sk-Br-3細(xì)胞包裝和擴(kuò)增(Lentivirus-PEDF-vector)，然后分別將有效干擾序列轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞，采用免疫熒光染色法檢測(cè)PEDF表達(dá)下調(diào)/

13、擴(kuò)增后對(duì)細(xì)胞骨架形態(tài)的影響;分析轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒后人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞PEDF蛋白表達(dá)的變化;
　　2.通過(guò)Transwell小室法侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒組、正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，分析PEDF-siRNA/Lentivirus-PEDF-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)于人乳腺癌Sk-Br-3

14、細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.應(yīng)用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，沉默PEDF基因，觀察乳腺癌細(xì)胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞的上皮性標(biāo)記E-cadherin、間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達(dá)的改變，探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程;
　　4.應(yīng)用慢病毒包裝包裝輔助質(zhì)粒技術(shù)，擴(kuò)增PEDF基因，轉(zhuǎn)染乳腺癌Sk-Br-3

15、細(xì)胞，觀察乳腺癌細(xì)胞體外增殖、侵襲、粘附特性的變化以及應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)人乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞的上皮性標(biāo)記E-cadherin、間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達(dá)的改變，探討PEDF基因在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程;
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.在Sk-Br-3細(xì)胞中抑制PEDF的表達(dá)和在Sk-Br-3細(xì)胞中升高PEDF的表達(dá)后進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明PEDF可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能

16、力。此外，在Sk-Br-3中過(guò)表達(dá)PEDF后，免疫熒光染色顯示Sk-Br-3細(xì)胞骨架形態(tài)由間質(zhì)樣變?yōu)樯掀印?br>　　2.Western blotting檢測(cè)正常對(duì)照組和陰性對(duì)照細(xì)胞組的PEDF蛋白表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒細(xì)胞組的蛋白表達(dá)水平，低于Lentivirus-vector質(zhì)粒細(xì)胞組的蛋白表達(dá)水平差異具有顯著性(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒組蛋白表達(dá)水平最低;
　　3.Western blotting檢測(cè)

17、在Sk-Br-3中過(guò)表達(dá)PEDF后結(jié)果顯示Sk-Br-3細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin的表達(dá)則顯著下調(diào);反而轉(zhuǎn)染PEDF-siRNA組結(jié)果顯示Sk-Br-3細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子的表達(dá)顯著下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)統(tǒng)計(jì)軟件。使用t檢驗(yàn)或方差分析細(xì)胞遷徙能力和蛋白表達(dá)狀況，統(tǒng)計(jì)