負性共刺激分子Tim3在腫瘤浸潤T淋巴細胞表達及調(diào)節(jié)的初步分析.pdf

1、目的：在分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者外周血T細胞和組織新鮮標(biāo)本(癌,癌旁組織)浸潤淋巴細胞(TILs)Tim3表達差異的基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實驗探討T-bet/Eomes是否參與了對Tim3表達的調(diào)節(jié),并進一步初步分析腫瘤微環(huán)境中Tim3表達的可能影響因素,為深入研究Tim3作為腫瘤免疫治療的新靶點的可行性提供實驗依據(jù)。
　　方法：⑴收集手術(shù)切除且診斷明確的非小細胞肺癌(NSCLC)患者癌組織及癌旁組織,同時采集同一患者外周血

2、,經(jīng)免疫熒光標(biāo)記和流式細胞儀分析檢測Tim3在在外周血T淋巴細胞和腫瘤浸潤T淋巴細胞的表達;⑵采用C57BL/6 WT和T-bet-/-/Eomes-/-DKO小鼠,富集小鼠脾臟T細胞,體外經(jīng)Th1型分化誘導(dǎo);同時構(gòu)建Lewis肺癌模型,分離小鼠脾臟T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞,免疫熒光標(biāo)記和流式細胞術(shù)檢測Tim3的表達情況,分析T-bet和Eomes是否參與了對Tim3表達的調(diào)節(jié);⑶收集人非小細胞肺癌標(biāo)本(癌組織和癌旁組織),抽提癌組織和

3、癌旁組織RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄、Real-TimePCR檢測IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、TNF、PD-L1、galectin-9、FoxP3、GATA3、T-bet、Eomes mRNA的相對表達量,初步篩選Tim3表達調(diào)節(jié)的可能影響分子。
　　結(jié)果：①與癌旁正常組織浸潤淋巴細胞相比,非小細胞肺癌患者腫瘤組織浸潤淋巴細胞(TILs)表面Tim3的表達明顯上調(diào);非小細胞肺癌患者外周血T細胞幾乎不表達Tim3

4、；②負性共刺激分子 Tim3在非小細胞肺癌腫瘤組織浸潤淋巴細胞呈現(xiàn)中度表達和低表達,部分非小細胞肺癌患者腫瘤組織Tim3低表達；③小鼠脾臟T淋巴細胞體外經(jīng)Th1分化條件培養(yǎng),T細胞,尤其是CD8+T細胞表面Tim3的表達在T-bet/Eomes雙敲基因(DKO)小鼠受到明顯抑制；④在小鼠lewis肺癌腫瘤模型中,脾臟淋巴細胞表面Tim3表達也受到T-bet/Eomes的調(diào)節(jié),而荷瘤小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞表面Tim3的表達并不受T-bet/

5、Eomes的調(diào)節(jié)；⑤腫瘤組織浸潤淋巴細胞表面 Tim3中度表達組與 Tim3低表達組相比,Eomes mRNA表達呈現(xiàn)顯著升高, TNF-α, IL-1β, IL-10三個因子表達顯著降低(p<0.01),而TGF-β、IL-6、T-bet和Gata3等的表達無顯著差異；⑥與癌旁組織相比,癌組織中Foxp3,IL-17以及Tim3配體Galectin-9 mRNA表達顯著升高,而IL-1β則顯著降低(p<0.01)。
　　結(jié)論：與

6、癌旁正常組織浸潤淋巴細胞相比,非小細胞肺癌患者腫瘤組織浸潤淋巴細胞(TILs)表面Tim3的表達明顯上調(diào);非小細胞肺癌患者外周血T細胞幾乎不表達Tim3;部分非小細胞肺癌患者腫瘤組織Tim3低表達。T-bet/Eomes參與了Tim3在外周免疫器官表達的調(diào)節(jié),但Tim3在腫瘤浸潤T淋巴細胞的表達可能和腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)有關(guān),Foxp3,IL-17以及Tim3配體Galectin-9 mRNA在腫瘤組織的表達較癌旁組織顯著升高,腫瘤組織Ti