14-3-3ζ和LKB1蛋白的結(jié)合對口腔鱗癌細胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：
　　口腔鱗癌(OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，然而口腔鱗癌的5年生存率僅30%-45%。本文將研究凋亡相關(guān)蛋白14-3-3δ和LKB1在口腔鱗癌細胞中的表達，以及14-3-3δ和LKB1在口腔鱗癌細胞凋亡或增殖調(diào)控中的相互關(guān)系，同時運用晶體學(xué)原理解析14-3-3δ和LKB1結(jié)合的分子基礎(chǔ)，并通過結(jié)構(gòu)設(shè)計突變、打破兩者的結(jié)合，進一步驗證14-3-3δ和LKB1的結(jié)合對口腔鱗癌細胞增殖或凋亡調(diào)控的影響。通過本研究，

2、擬為生物學(xué)靶向治療口腔鱗癌的靶點設(shè)計研究打下一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以期為口腔鱗癌提供一種新的治療策略。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)與蛋白免疫印跡法分別在mRNA與蛋白水平檢測14-3-3δ在口腔原代上皮細胞和口腔鱗癌細胞系CAL27的表達差異。通過流式細胞技術(shù)觀察14-3-3δ基因表達沉默或過表達對口腔鱗癌細胞增殖或凋亡的影響。
　　2.免疫共沉淀實驗驗證14-3-3δ和LKB1在口腔鱗癌細胞內(nèi)的

3、結(jié)合。同時應(yīng)用蛋白質(zhì)純化技術(shù)得到14-3-3δ和LKB1的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過晶體學(xué)方法解析得到14-3-3δ和LKB1的蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
　　3.通過復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，設(shè)計LKB1突變質(zhì)粒，并將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至口腔鱗癌細胞系CAL27，通過免疫共沉淀實驗驗證兩者在細胞內(nèi)的分離，并應(yīng)用流式細胞技術(shù)進一步觀察LKB1突變后對腫瘤細胞增殖或凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.口腔鱗癌細胞CAL27在mRNA與蛋白水平14-3

4、-3δ的表達量都要高于口腔原代上皮細胞。14-3-3δ過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入口腔鱗癌細胞系CAL27后，口腔鱗癌細胞發(fā)生了明顯的增殖。14-3-3δ基因表達沉默后，口腔鱗癌細胞發(fā)生了明顯的凋亡。
　　2.免疫共沉淀實驗顯示在口腔鱗癌CAL27細胞系內(nèi)14-3-3δ和LKB1發(fā)生了明顯的結(jié)合，而在原代口腔上皮細胞內(nèi)14-3-3δ和LKB1的結(jié)合不明顯。計算機晶體結(jié)構(gòu)軟件分析14-3-3δ和LKB1晶體衍射結(jié)果顯示：14-3-3δ和LKB1可