三羥異黃酮對(duì)光動(dòng)力學(xué)療法抗腫瘤治療的增效作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamictherapy，PDT)已經(jīng)成為一種有效的抗腫瘤治療方法，但是現(xiàn)有PDT所用照射光對(duì)組織的穿透深度有限，使深部腫瘤組織受到的PDT作用強(qiáng)度顯著減弱，影響了PDT對(duì)深部腫瘤的作用效果并限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用。同時(shí)，PDT不僅能通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)或PDT的直接光毒性作用抑制腫瘤的增殖；亞致死劑量PDT作用還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生逃避反應(yīng)，并可能使腫

2、瘤細(xì)胞逃避打擊。因而深入研究PDT作用機(jī)制及其量效作用特點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的逃避反應(yīng)并增強(qiáng)PDT作用效果是重要的臨床研究課題。本研究將血卟啉衍生物(hematoporphyrinderivativ，HpD)介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法與小劑量酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)抑制劑三羥異黃酮(genistein，GEN)協(xié)同應(yīng)用，觀察其對(duì)腫瘤抑制的增強(qiáng)作用；并觀察不同強(qiáng)度PDT作用對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化與去磷酸化動(dòng)態(tài)平

3、衡、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactor1，HIF-1)及其靶基因血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表達(dá)的影響以及GEN的干預(yù)作用，為深入了解PDT的作用機(jī)制及量效作用特點(diǎn)，探索PDT臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)研究以小鼠肝癌細(xì)胞株H22為研究對(duì)象，以MTT法檢測(cè)不同強(qiáng)度PDT及不同劑量GEN單獨(dú)或協(xié)同作用對(duì)H22細(xì)胞的增殖抑制作

4、用；分別以同位素檢測(cè)、吸光度檢測(cè)、westernblot、EMSA和RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法，觀察不同強(qiáng)度PDT直接作用后H22細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性、蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase，PTP)活性、細(xì)胞HIF-1α蛋白含量、胞核HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變及量效特點(diǎn)，以及GEN干預(yù)后上述檢測(cè)指標(biāo)的變化；建立H22細(xì)胞荷

5、瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察PDT及GEN單獨(dú)或協(xié)同應(yīng)用對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積及生存時(shí)間的影響，以免疫組化法檢測(cè)PDT作用對(duì)小鼠腫瘤組織HIF-1蛋白、VEGF蛋白及新生微血管密度(MVD)表達(dá)的影響，以及GEN的干預(yù)作用。 結(jié)果：1.在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度在0.25J/cm2至8J/cm2范圍時(shí)，PDT可以顯著抑制H22細(xì)胞的增殖，抑制程度與光能量密度相關(guān)，半數(shù)抑制劑量(IC50)為1.9957J/

6、cm2。 2.10-8mol/L的GEN單獨(dú)作用雖不能抑制H22細(xì)胞的增殖，但能顯著增強(qiáng)PDT對(duì)H22細(xì)胞的增殖抑制作用，其中在小劑量PDT作用時(shí)(小于IC50)，GEN的增效作用非常顯著。 3.當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度大于0.5J/cm2，PDT作用強(qiáng)度大于IC30時(shí)，PDT作用對(duì)H22細(xì)胞PTK、PTP活性均顯著抑制，同時(shí)PTK/PTP活性比值呈劑量依賴性下降；光照能量密度小于0.5J/cm2，PDT

7、作用強(qiáng)度小于IC30時(shí)，PDT作用主要表現(xiàn)為對(duì)H22細(xì)胞PTP活性的抑制，PTK/PTP活性比值相對(duì)升高。 4.10-8mol/L的GEN能夠顯著降低不同強(qiáng)度PDT作用后H22細(xì)胞PTK活性，提高PTP相對(duì)活性，顯著降低PTK/PTP活性比值。 5.當(dāng)HpD濃度為5μg/ml，光照能量密度大于0.5J/cm2，PDT作用強(qiáng)度大于IC30時(shí)，PDT作用呈劑量依賴性的抑制H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及V

8、EGFmRNA表達(dá)；光照能量密度小于0.5J/cm2，PDT作用強(qiáng)度小于IC30時(shí)，PDT作用可以導(dǎo)致H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及VEGFmRNA表達(dá)升高；PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的不同量效影響作用隨時(shí)間延長(zhǎng)有顯著減弱。 6.10-8mol/L的GEN能夠顯著降低不同強(qiáng)度PDT作用后H22細(xì)胞HIF-1α蛋白水平、HIF-1結(jié)合活性及VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。 7.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在10mg/kg的Hp

9、D介導(dǎo)下，200J/cm2治療劑量的PDT作用后，腫瘤組織HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高；GEN的協(xié)同使用能顯著降低PDT作用后腫瘤組織的HIF-1α、VEGF蛋白水平及新生微血管密度(MVD)。 8.GEN與PDT的聯(lián)合應(yīng)用能較PDT或GEN的單獨(dú)作用更為顯著的延緩荷瘤小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。 結(jié)論：1.在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HpD介導(dǎo)PDT與小劑量酪氨酸激酶抑制劑GEN的聯(lián)合應(yīng)用能較

10、PDT或GEN的單獨(dú)作用更為顯著的抑制腫瘤增殖，小劑量GEN能顯著增強(qiáng)HpD介導(dǎo)PDT的抗腫瘤作用療效。 2.在體外實(shí)驗(yàn)中，HpD介導(dǎo)PDT的直接作用對(duì)H22細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶、磷酸酶活性及HIF-1相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑有重要的調(diào)節(jié)作用并有顯著的量效關(guān)系：大于0.5J/cm2劑量的PDT作用能夠呈劑量依賴性的降低H22細(xì)胞PTK/PTP活性比值、HIF-1α蛋白含量、HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而小于0.5J

11、/cm2劑量的PDT作用可導(dǎo)致H22細(xì)胞PTK/PTP活性比值、HIF-1α蛋白含量、HIF-1DNA結(jié)合活性、VEGFmRNA含量升高。 3.在體外實(shí)驗(yàn)中，小劑量GEN可同時(shí)干預(yù)不同強(qiáng)度PDT作用后H22細(xì)胞PTK和PTP活性，降低PTK/PTP活性比值，促進(jìn)HIF-1α蛋白降解，抑制HIF-1活化及VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄。 4.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小劑量GEN能顯著降低HpD介導(dǎo)PDT作用后腫瘤組織的HIF-1α、VEGF蛋