周期素依賴性蛋白激酶抑制劑3′單肟靛玉紅對(duì)Alzheimer病治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年期癡呆的最常見(jiàn)的類型，其臨床特點(diǎn)包括記憶力障礙、認(rèn)知功能損害及行為異常。AD的發(fā)病率隨著年齡的增加而上升。AD給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)和醫(yī)療問(wèn)題。但是到目前為止，AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床缺乏理想的治療藥物。因此，研究AD的發(fā)病機(jī)制及研發(fā)有效的防治藥物顯得尤為重要。 AD病理上以大腦出現(xiàn)細(xì)胞外老年斑(senile plaques，S

2、P)、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTS)和神經(jīng)元及突觸減少為特征，特定區(qū)域神經(jīng)元的喪失不僅是腦萎縮的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，還是引起患者臨床學(xué)習(xí)和記憶障礙的關(guān)鍵。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，AD發(fā)病過(guò)程中周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dendent kinases，Cdl(s)的異常激活可以導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。 Cdks抑制劑最早用于癌癥的治療，最近已經(jīng)有利用Cdks抑制劑作為神經(jīng)

3、保護(hù)劑的研究報(bào)道，但是大部分資料來(lái)自體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，僅有少數(shù)研究來(lái)自神經(jīng)變性和凋亡動(dòng)物模型。雖然Cdks抑制劑治療AD的可能機(jī)制尚不完全清楚，但是cdks抑制劑已經(jīng)用于研究異常的Cdks活性與神經(jīng)變性性疾病的關(guān)系。Cdks抑制劑極可能成為治療AD的重要靶標(biāo)。 靛玉紅(indimbin)是中國(guó)醫(yī)學(xué)家們?cè)趥鹘y(tǒng)中成藥當(dāng)歸蘆薈丸中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤有效成分。目前已經(jīng)清楚靛玉紅是一種選擇性的IgNCdks抑制劑，它可以在納摩爾水平抑制Cdk1、

4、Cdk2、Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的肝毒性。然而，靛玉紅的衍生物：3，單肟靛玉紅(Indimbin-3’-monoxime，IMX)，不僅是強(qiáng)有力的Cdks抑制劑，而且毒性低、分子量小、有較好的膜通透性，IMx可以與ATP競(jìng)爭(zhēng)Cdks激酶的催化位點(diǎn)。本文工作旨在研究Cdks在Aβ<,1-40>誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型中表達(dá)情況，并在此基礎(chǔ)上研究Cdks抑制劑IMx對(duì)AD動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)性治療作用。本實(shí)驗(yàn)不僅為AD的治療

5、探索新的途徑和尋找有效的新藥物，也為把IMx研發(fā)成臨床新藥積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文包括以下三部分工作： 第一部分 Cdk4和cyclin B1在AD動(dòng)物模型中的表達(dá)分析 目的：研究周期素依賴性蛋白激酶和周期素在Ap<,1-40>誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型中的表達(dá)及其與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。 方法：應(yīng)用Ap<,1-40>側(cè)腦室內(nèi)持續(xù)給藥建立AD大鼠模型；應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)周期素依賴性蛋白激酶CdK4和周期素cyclin B1的表達(dá)

6、；應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡；應(yīng)用熒光雙標(biāo)的方法確定cdk4表達(dá)的細(xì)胞類型，同時(shí)還進(jìn)行了Cdk4}Lcyclin B1與TUNEL的熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：(1)Cdk4和cyclin B1于造模后7天就達(dá)較高水平，21天達(dá)高峰，直到28天仍然持續(xù)表達(dá)；(2)AD動(dòng)物模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞于造模后14天開始出現(xiàn)，21天達(dá)高峰并且少量持續(xù)存在；(3)存在cdk4與神經(jīng)元標(biāo)志性抗體的雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；(4)發(fā)現(xiàn)Cdk4和cycl

7、in B1與TUNEL的雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：Cdks參與了Ap毒性引起的神經(jīng)元凋亡機(jī)制，Cdks抑制劑可能減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。 第二部分 Cdks抑制劑3’單肟靛玉紅的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 目的：本實(shí)驗(yàn)研究IMx在體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程及其能否進(jìn)入腦內(nèi)，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 方法：利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定大鼠血液中IMX的含量；分別研究靜脈注射、腹腔注射兩種給藥途徑后，IMX在大鼠體

8、內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，應(yīng)用3P87藥物代謝動(dòng)力學(xué)程序，計(jì)算出主要的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)；并進(jìn)一步觀察了靜脈給藥后藥物在動(dòng)物體內(nèi)主要器官心、肺、腎、腦組織中IMX的含量。 結(jié)果：(1)鼠尾靜脈注射IMX，藥物代謝動(dòng)力學(xué)符合二室模型。IMX在鼠體內(nèi)吸收快，分布也快，藥物起效快，在體內(nèi)主要以消除過(guò)程為主，藥物在體內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)；(2)腹腔注射IMX后，在150min血藥濃度達(dá)峰值。靜脈注射10 mg/kg IMX，于不同時(shí)間處死，用H

9、PLC測(cè)定各組織中IMX的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：I-ND(在心臟組織中含量較高，在1h達(dá)峰值；腦組織、肺組織中IMx含量在O.5h即達(dá)峰值；腎臟組織中IMx含量在3h達(dá)峰值，結(jié)合其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征推測(cè)，IMX易于透過(guò)血腦脊液屏障，以被動(dòng)擴(kuò)散為主，IMX主要分布在體循環(huán)和血流豐富的臟器中。 結(jié)論：應(yīng)用HPLC法測(cè)定大鼠血漿中IMx的濃度，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、精密度及重現(xiàn)性均較好。靜脈注射IMX，藥物代謝動(dòng)力學(xué)符合二室模型，IMx在鼠血中主要以消

10、除過(guò)程為主，IMX主要分布在血流豐富的組織中，分布速率較快。IMX易于透過(guò)血腦脊液屏障，以被動(dòng)擴(kuò)散為主。 第三部分 IMx對(duì)AD動(dòng)物模型行為學(xué)的影響及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究 目的：研究IMX對(duì)AD大鼠神經(jīng)元凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能的影響及可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。 方法：應(yīng)用Ap<,1-40>側(cè)腦室給藥建立AD大鼠模型。成年健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成：假手術(shù)組、AD模型組、IMX干預(yù)組Ⅰ(7.5mg/Kg i．p．)、IM

11、X干預(yù)組Ⅱ(15mg/g i．p．)。IMX干預(yù)組在造模前1天經(jīng)腹腔給藥。造模后第7、14、21天行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能的改變；行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后應(yīng)用組織切片原位末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)對(duì)額顳葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡進(jìn)行分析；應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)Cdk4和周期素cyclin B1的表達(dá)；同時(shí)還觀察IMX對(duì)Cdc2激酶和ChAT活性的影響。 結(jié)果：(1)Morris水迷宮實(shí)

12、驗(yàn)顯示IMX治療組Ⅰ和IMX治療組Ⅱ大鼠的平均逃避潛伏期分別為58.7±6.34s和48.8 ±7.83s較AD模型組(66.9±6.52s)明顯縮短，t=2.85(IMX治療組Ⅰ，P

13、百分率為35.88±6.26％和11.21 ±2.15％；(3)IMX干預(yù)組Ⅰ大鼠的皮層和海馬CAl區(qū)神經(jīng)元凋亡百分率為13.22 ±5.23％和3.65±O.75％，低于AD模型組；IMX干預(yù)組Ⅱ大鼠的皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡百分率為11.91±3.34％和2.58 ±O.57％，低于AD模型組；(4)與AD模型組相比，IMX干預(yù)組Cdk4和cyclin B1的表達(dá)減少、Cdc2激酶活性下降和ChAT活性升高。 結(jié)論：Cd