BMSCs和HAPO治療異丙腎上腺素誘導(dǎo)的DCM的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)為原發(fā)性心肌病中最常見(jiàn)的類(lèi)型，是繼冠心病、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病之后的常見(jiàn)心臟疾病，更是造成充血性心力衰竭的主要原因之一，且常伴心力衰竭及多種惡性心律失常，目前尚無(wú)理想的治療方法。盡管病因不明，但心肌細(xì)胞的喪失和纖維組織增生是心功能衰竭的根源。因此，具有自我更新和多分化潛能的干細(xì)胞和促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子逐漸進(jìn)入人們的視線并成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(B

2、onemarrowmesenchymalcells，BMSCs)在體內(nèi)可分化為心肌細(xì)胞，并改善心功能。細(xì)胞的植入方式有多種，但不同方式之間的療效比較尚未見(jiàn)報(bào)道，而經(jīng)左室心腔內(nèi)注射植入較經(jīng)靜脈植入細(xì)胞外周滯留少，又較心肌內(nèi)注射簡(jiǎn)便易行，故將其與左室心肌內(nèi)局部注射植入的效果進(jìn)行比較，以為選擇最佳方式提供依據(jù)。促血液血管細(xì)胞生成素(Hemangiopoietin，HAPO)，是一種對(duì)原始成血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系的生存和增殖均有支持作用的新型生長(zhǎng)

3、因子，據(jù)報(bào)道，具有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖作用、抗細(xì)胞調(diào)亡作用和機(jī)體的放射性保護(hù)作用。鑒于促血管新生和抗細(xì)胞調(diào)亡在干細(xì)胞移植和細(xì)胞因子修復(fù)心肌損傷中所起的重要作用，本試驗(yàn)又將HAPO應(yīng)用到異丙腎誘導(dǎo)的心肌病動(dòng)物模型，以觀療效，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：本研究利用經(jīng)肌肉注射異丙基腎上腺素(Isoproterenol，Iso)85mg/kg/次，每日1次，連續(xù)3日，共3次，總量為255mg/kg，可成功建立Iso誘導(dǎo)大鼠DCM模型，為進(jìn)

4、一步的研究提供可靠平臺(tái)。經(jīng)超聲心動(dòng)、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查證實(shí)后，分為左室心腔內(nèi)注射移植組、左室心肌內(nèi)局部注射移植組和等量生理鹽水左室心肌內(nèi)注射組，每個(gè)亞組n=10；HAPO治療組(每次300μg/kg，腹腔注射，1次/日×14天)和生理鹽水注射對(duì)照組，每個(gè)亞組n=10。采用超聲心動(dòng)及生理多導(dǎo)儀檢測(cè)各組射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮壓峰值(LVSP)、左

5、室舒張末壓(LVEDP)以及左室壓力最大上升或下降速率(+dp/dtmax，-dp/dtmax)等心功能指標(biāo)；采用普通病理學(xué)及Masson氏三色素染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；應(yīng)用Westernblot法行凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas檢測(cè)；免疫組化染色行VEGF和CD34抗原檢測(cè)；RT-PCR半定量法行VEGF、SDF-1、CXCR、MMP-2、MMP-9、TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平檢測(cè)；免

6、疫熒光染色后于共聚焦顯微鏡下行移植細(xì)胞鑒定、定位和定性檢查。 結(jié)果：(一)第一部分：經(jīng)Iso誘導(dǎo)的DCM大鼠模型，在心功能、血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)及組織病理等方面均符合DCM的改變。 (二)第二部分：1.BMSCs左室心腔內(nèi)注射植入組、心肌內(nèi)局部注射植入組與對(duì)照組相比：EF(84.64±4.32％，82.62±5.06％vs66.73±2.94％)、FS(56.58±5.62％，55.25±4.54％vs38.27±4.12％)

7、、LVSP(119.7±12.3mmHg，111.2±11.6mmHgvs85.15±3.35mmHg)、+dp/dtmax(7563.8±578.6mmHg/s，7157.6±632.2mmHg/svs4462.2±368.7mmHg/s)和-dp/dtmax(5104.6±326.9mmHg/s，5013.6±312.6mmHg/svs4258.7±347.3mmHg/s)均有明顯升高(P＜0.05)，而LVDd(6.12±0.31

8、mm，6.06±0.36mmvs6.82±0.31mm)、LVDs(2.47±0.15mm，2.91±0.36mmvs4.56±0.43mm)和LVEDP(9.3±2.3mmHg，11.5±2.4mmHgvs20.4±3.7mmHg)均明顯降低(P＜0.05)。2.左室心腔內(nèi)注射植入組與心肌內(nèi)局部注射植入組相比，在EF、FS、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDd、LVDs、LVEDP等方面無(wú)明顯差異(P＞0.05)

9、。3.經(jīng)免疫熒光檢測(cè)證明，無(wú)論左室心腔內(nèi)注射植入組還是心肌內(nèi)局部注射植入，BMSCs均可植活并能分化為心肌細(xì)胞。心肌內(nèi)注射組的BMSCs早期于心肌內(nèi)大體上呈帶狀的區(qū)域性分布，而心腔內(nèi)注射組BMSCs則呈分散的粟粒樣、局灶性分布，更具靶向性和優(yōu)越性。4.左室心腔內(nèi)注射植入組、心肌內(nèi)局部注射植入組與對(duì)照組比較：凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)增高、Bax表達(dá)降低，而二者間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。5.BMSCs移植組與對(duì)照組比較，心肌VEGF表

10、達(dá)無(wú)論在mRNA水平還是在蛋白水平均明顯增加，而不同移植方式組間則無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；CD34抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則依心腔內(nèi)注射組、心肌內(nèi)注射組和心肌病對(duì)照組順序遞減。(6.62±0.64個(gè)/0.2mm2，4.13±0.7個(gè)/0.2mm2vs1.12±0.42個(gè)/0.2mm2，P＜0.05)。7.SDF-1和CXCRmRNA表達(dá)水平依心腔內(nèi)注射組、心肌內(nèi)注射組和對(duì)照組順序遞減。8.對(duì)照組部分肌原纖維溶解，心肌纖維斷裂，呈灶性壞死；心

11、肌細(xì)胞間隙增寬、膠原纖維增多，而B(niǎo)MSCs移植組上述情況均明顯好轉(zhuǎn)。 (三)第三部分：1.HAPO組與心肌病對(duì)照組比較，EF(87.43±7.21％vs81.96±6.03％)、FS(59.74±3.65％vs35.28±3.24％)、LVSP(132.6±5.4％vs89.2±7.4％)、+dp/dtmax(6418.8±378.5vs4353.8±265.8mmHg/s)和-dp/dtmax(6170.3±202.3mmHg

12、/svs4271.5±256.6mmHg/s)明顯升高(P＜0.05)，而LVDd(4.82±0.19vs6.52±0.53mm)、LVDs(2.43±0.22mmvs4.52±0.32mm)和LVEDP(13.3±1.8mmHgvs19.5±2.6mmHg)則顯著降低(P＜0.05)。2.DCM對(duì)照組部分肌原纖維溶解，心肌纖維斷裂，呈灶性壞死；心肌細(xì)胞間隙增寬、膠原纖維增多，而HAPO治療組上述情況明顯好轉(zhuǎn)。3.HAPO治療組與對(duì)照組

13、比較，心肌VEGF的蛋白表達(dá)和CD34抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而MMP-2和MMP-9抗原表達(dá)水平降低，差異有顯著性(P＞0.05)。4.與對(duì)照組比較，HAPO治療組的VEGF和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，TGF-β1、MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，而Ⅲ型膠原無(wú)顯著變化(P＞0.05)。5.與鹽水注射對(duì)照組比較，HAPO治療組促凋亡蛋白Fas表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

14、結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肌肉注射異丙腎上腺素85mg/kg/次，每日1次，連續(xù)3日，共3次，總量255mg/kg，可成功建立Iso誘導(dǎo)大鼠DCM模型，以為進(jìn)一步的研究提供可靠的研究平臺(tái)。2.植入BMSCs治療Iso誘導(dǎo)的DCM，無(wú)論經(jīng)左室心腔內(nèi)注射和心肌內(nèi)局部注射植入均可使擴(kuò)大的心臟明顯縮小并顯著改善心臟功能。3.BMSCs心腔內(nèi)注射植入在心肌內(nèi)具有更好的靶向性和優(yōu)越性。4.予以BMSCs移植治療Iso誘導(dǎo)的DCM，無(wú)論左室心腔內(nèi)注射還

15、是心肌內(nèi)局部注射植入均可在心臟成功植活并分化為心肌細(xì)胞。心肌新生以多細(xì)胞的歸巢、聚集、融合和分化為主。5.BMSCs移植組與對(duì)照組比較，抗凋亡蛋白表達(dá)增強(qiáng)，促凋亡蛋白表達(dá)減弱，提示移植細(xì)胞也可能通過(guò)某種機(jī)制影響心肌細(xì)胞凋亡。6.經(jīng)左室心腔內(nèi)注射和心肌內(nèi)局部注射植入MSC治療Iso誘導(dǎo)的DCM，兩者在療效上無(wú)顯著差異，在抑制細(xì)胞凋亡和組織學(xué)改變上亦無(wú)顯著差別。7.在SDF-1、CXCR4表達(dá)和CD34抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增高的程度上，心腔內(nèi)注射