薏米多酚的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究.pdf

1、薏米是我國(guó)最古老的作物之一，作為一種傳統(tǒng)的健康食品，薏米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，被譽(yù)為“禾本科植物之王”，其活性成分的研究一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究先采用80％丙酮提取薏米粉末制得薏米多酚粗提物，再用正丁醇萃取得到正丁醇相提取物，正丁醇相提取物經(jīng)葡聚糖LH-20凝膠柱進(jìn)一步純化制得薏米多酚亞組分純化物，最后用半制備液相純化得到4種酚類(lèi)化合物后，采用HPLC-DAD-ESI-MS,1H NMR,和13C NMR技術(shù)分析薏米多酚的結(jié)構(gòu)；以福林-

2、酚法測(cè)定各組分總酚含量，以氧自由基吸收能力（ORAC)、清除過(guò)氧化氫自由基能力法(PSC)和細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)(CAA)三種方法測(cè)定薏米多酚各級(jí)分的抗氧化活性；以MTT法測(cè)定薏米多酚各級(jí)分的抗腫瘤活性；進(jìn)一步采用倒置顯微鏡觀察技術(shù)結(jié)合Western bot實(shí)驗(yàn)，探討薏米多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　1、薏米多酚的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定
　　采用80%丙酮溶液提取薏米粉末制得薏米多酚粗提物，再用正丁醇將粗提物萃取得到正丁醇相提取物，

3、正丁醇相提取物經(jīng)葡聚糖LH-20凝膠柱進(jìn)一步純化制得薏米多酚亞組分純化物，最后亞組分純化物經(jīng)半制備液相純化得到4種酚類(lèi)化合物。采用HPLC-DAD-ESI-MS,1H NMR,和13C NMR分析薏米多酚純品的結(jié)構(gòu)；采用HPLC-DAD測(cè)定薏米多酚粗提物、萃取物及亞組分中多種酚類(lèi)化合物的含量。結(jié)果表明：薏米多酚粗提物、正丁醇相、水相、亞組分一和亞組分二中含量最多的酚類(lèi)化合物均為N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺（含量分別為：12.33±0

4、.53mg/g，16.01±0.81mg/g，4.41±0.02mg/g，2.02±0.03mg/g和106.41±3.43mg/g），亞組分三中含量最多的酚類(lèi)化合物為阿魏酸（含量為62.90±2.12mg/g）。四種酚類(lèi)化合物經(jīng)鑒定，分別為：N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺（1）、對(duì)香豆酸（2）、阿魏酸（3）、蘆?。?）。
　　2、薏米提取物各組分的總酚含量及抗氧化活性
　　采用福林-酚法測(cè)定各組分總酚含量，以抗氧化能力指

5、數(shù)（ORAC)、清除氧化氫自由基能力法（PSC）和細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)（CAA）三種方法測(cè)定提取物各級(jí)分和多酚純品的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在薏米多酚粗提物、正丁醇相提取物和水相提取物中，正丁醇相提取物總酚含量最高（43.84±2.94mg GAE/g），抗氧化能力最強(qiáng)（ORAC值：717.65±33.88μmol TE/g，PSC值：185.59±15.92μmol TE/g，CAA值：41.38±0.55μmol QE/g）；在亞組分中

6、，亞組分三總酚含量最高（183.42±3.27mg GAE/g），抗氧化能力最強(qiáng)（ORAC值：2500.76±65.10μmol TE/g，PSC值：1454.45±72.55μmol TE/g，CAA值：153.57±8.51μmol QE/g）；在多酚純品中，對(duì)香豆酸ORAC值最高（6975.22±210.36μmol TE/g），阿魏酸PSC值最高（2367.95±111.21μmol TE/g），蘆丁CAA值最高（1143.88

7、±80.98μmol QE/g）。
　　3、薏米提取物各組分抗腫瘤活性
　　采用MTT比色法分析薏米提取物各級(jí)分及多酚純品對(duì)人體HepG-2肝癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞及CaCo-2結(jié)腸癌細(xì)胞的體外抗增殖活性。結(jié)果表明，在腫瘤細(xì)胞可生長(zhǎng)的濃度范圍內(nèi)，薏米多酚粗提物、正丁醇相提取物、亞組分二、亞組分三、N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺、對(duì)香豆酸和阿魏酸對(duì)三種細(xì)胞均有一定的抗增殖作用，且抑制效果與處理濃度呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，其中

8、HepG-2肝癌細(xì)胞對(duì)薏米提取物及多酚純品的作用最為敏感，CaCo-2結(jié)腸癌細(xì)胞敏感性最弱。在所有薏米提取物及多酚純品中，N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺的抗增殖活性最強(qiáng)，IC50值分別為：46.34±3.99μg/mL（HepG-2），61.52±6.02μg/mL（MCF-7），92.69±5.63μg/mL（CaCo-2）。
　　4、N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的影響
　　以不同濃度的N1,N

9、5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺處理HepG-2細(xì)胞48h,采用倒置微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的變形并伴隨著數(shù)目的減少，細(xì)胞變圓，邊緣變得模糊，表明N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺在體外可顯著改變HepG-2細(xì)胞形態(tài)引起細(xì)胞凋亡。采用Western bot實(shí)驗(yàn)分析N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)cytochrome c,caspase-9,caspase-3,Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示N1,N5-雙