應(yīng)用單個(gè)鎖核酸修飾的探針提高對(duì)非互補(bǔ)雜交識(shí)別能力的研究.pdf

1、目的： DNA雙鏈的完全互補(bǔ)雜交是進(jìn)行微陣列分析、SNP鑒別、基因表達(dá)分析、序列測(cè)定、以及其它檢測(cè)的基礎(chǔ)。為了達(dá)到檢測(cè)的準(zhǔn)確性，寡核酸探針必須能夠特異地識(shí)別其靶標(biāo)DNA或RNA鏈，從而通過完全互補(bǔ)雜交形成穩(wěn)定的雙鏈。同時(shí)，每個(gè)探針必須能夠有效地識(shí)別那些包含錯(cuò)配、插入或缺失的非互補(bǔ)鏈從而避免形成非互補(bǔ)的雙鏈。因此，設(shè)計(jì)的探針應(yīng)該能夠最大程度地提高互補(bǔ)雜交和非互補(bǔ)雜交雙鏈的解鏈溫度的差值，從而在選定的雜交溫度下，只有靶標(biāo)核酸才能與

2、探針結(jié)合，而非靶標(biāo)核酸不能與探針結(jié)合。然而，在實(shí)際檢測(cè)中，在同一檢測(cè)樣品溶液中有很多的DNA和RNA樣品，它們的核酸序列與正配的靶標(biāo)僅相差一個(gè)或兩個(gè)堿基，因此，它們的Tm值有可能與正配的Tm值相差僅有0.5℃或更小，這樣它們將會(huì)干擾靶標(biāo)和探針形成雜交雙鏈，從而產(chǎn)生假陽性信號(hào)。為了提高DNA或RNA鏈的識(shí)別能力和對(duì)錯(cuò)配堿基的區(qū)分能力，目前已有許多應(yīng)用寡核苷酸類似物的報(bào)道，如硫代磷酸寡核苷酸、2’—O—甲基化寡核苷酸、PNA(肽核酸)、2’

3、—氟代—N3-P5’—亞磷酰胺、5’—anhydrohexitol nucleic acids(HNAs)等，這些核酸類似物形成的雜化雙鏈均具有很好的熱穩(wěn)定性，但均因具有某些缺點(diǎn)而限制了其使用。LNA是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，含有一個(gè)或多個(gè)2’—O，4'—C—亞甲基—B—D—呋喃核糖核酸單體，核糖的2'—O和4'—C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形。這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3—內(nèi)趨型的N結(jié)構(gòu)

4、，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。寡核苷酸中摻入LNA可使Tm值升高，LNA—DNA互補(bǔ)雜交雙鏈的解鏈溫度可升高3—9.6℃。然而，關(guān)于LNA修飾的探針如何提高對(duì)非互補(bǔ)的DNA或RNA片段的識(shí)別的研究卻少有報(bào)道。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們系統(tǒng)地研究了20-mer和30-mer的雜交雙鏈中錯(cuò)配與插入堿基的化學(xué)性質(zhì)，位置，數(shù)目及協(xié)同效應(yīng)對(duì)雜交雙鏈穩(wěn)定性的影響，總結(jié)了相關(guān)的穩(wěn)定性趨勢(shì)；應(yīng)用溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證錯(cuò)配

5、雙鏈的不穩(wěn)定性。研究了LNA修飾的探針對(duì)雙鏈穩(wěn)定性的影響及對(duì)非互補(bǔ)核酸鏈的識(shí)別能力。設(shè)計(jì)了LNA修飾的探針和一組包含不同的錯(cuò)配及插入的DNA寡核酸鏈作為靶標(biāo)，系統(tǒng)地研究錯(cuò)配與插入堿基的化學(xué)性質(zhì)，位置，數(shù)目及協(xié)同效應(yīng)對(duì)LNA—DNA雜交雙鏈穩(wěn)定性的影響，同時(shí)，還應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了單個(gè)LNA修飾的探針對(duì)錯(cuò)配的識(shí)別能力。這些結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)LNA修飾的探針以進(jìn)行DNA或RNA檢測(cè)提供了非常有價(jià)值的信息。 方法： 1、

6、大腸桿菌培養(yǎng) 從—80℃冰箱中取出凍存的大腸桿菌，用無菌牙簽迅速挑出少量菌液放入LB培養(yǎng)基中，用鋁箔封好，在37℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)以上。 2、大腸桿菌DNA提取 取飽和大腸桿菌菌液2ml，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取大腸桿菌基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。 3、解鏈溫度測(cè)定 紫外分光光度計(jì)測(cè)定雜交核酸的解鏈曲線，軟件處理得到解鏈曲線，利用一階導(dǎo)數(shù)確定雜交雙鏈的解鏈溫度。

7、 4、溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn) 溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證錯(cuò)配雙鏈的不穩(wěn)定性。 5、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)研究了單個(gè)LNA修飾的引物對(duì)錯(cuò)配的識(shí)別能力。 6、普通PCR實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用普通PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證單個(gè)LNA修飾的引物對(duì)錯(cuò)配的識(shí)別能力。 結(jié)果： 1、單堿基錯(cuò)配對(duì)雙鏈熱穩(wěn)定性的影響 當(dāng)雜交雙鏈中含有單堿基錯(cuò)配時(shí)，雙鏈變得不穩(wěn)定，它們的解鏈曲線與完全互補(bǔ)的雙鏈相比發(fā)

8、生了向左偏移，這表明它們的解鏈溫度明顯降低。 2、雙堿基錯(cuò)配對(duì)雙鏈熱穩(wěn)定性的影響 兩對(duì)堿基錯(cuò)配可使雙鏈的的解鏈曲線進(jìn)一步左移，說明解鏈溫度發(fā)生了進(jìn)一步的下降。雙堿基錯(cuò)配的不穩(wěn)定性還表現(xiàn)在解鏈范圍的增大。 3、錯(cuò)配位點(diǎn)對(duì)雙鏈熱穩(wěn)定性的影響 隨著錯(cuò)配位置由邊緣向中心的趨近，解鏈溫度逐步下降，并在中心點(diǎn)上表現(xiàn)出了最大的影響效應(yīng)。表明錯(cuò)配發(fā)生在核酸片段中心部位時(shí)，錯(cuò)配的堿基將其分割為兩個(gè)較短的核酸片段，能夠最大限

9、度地破壞雜交雙鏈的穩(wěn)定性。 4、插入對(duì)雙鏈熱穩(wěn)定性的影響 同錯(cuò)配一樣，堿基插入同樣會(huì)破壞雙鏈的穩(wěn)定性，兩個(gè)或三個(gè)堿基的插入要比單堿基插入和單堿基錯(cuò)配更不穩(wěn)定。 5、溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在溫度梯度PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，引物能夠與模板實(shí)現(xiàn)完全互補(bǔ)雜交、單堿基錯(cuò)配雜交及雙堿基錯(cuò)配雜交。但是隨著雜交溫度的升高，與模板有兩個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配的雙堿基錯(cuò)配引物擴(kuò)增效率<單堿基錯(cuò)配雜交<完全互補(bǔ)雜交。 6、LNA提高

10、雙鏈穩(wěn)定性的作用 當(dāng)雜交雙鏈中包含有完全互補(bǔ)的LNA：DNA堿基對(duì)A：t，a：T，G：c或g：C時(shí)，它們的解鏈溫度與相應(yīng)的DNA—DNA雙鏈相比提高了4.2～5.0℃。當(dāng)LNA—DNA雙鏈中包含有兩對(duì)LNA：DNA堿基對(duì)如C：g+t：A或c：G+T：a，它們的解鏈溫度分別增高了7.7℃和7.1℃。當(dāng)探針和靶標(biāo)中各含有一個(gè)LNA堿基并可形成含有LNA：LNA堿基對(duì)A：T或G：C的完全互補(bǔ)的雜交雙鏈時(shí)，雜交雙鏈的解鏈溫度與相應(yīng)的DN

11、A—DNA雙鏈相比分別提高了6.5℃和8.0℃。說明在一對(duì)堿基對(duì)中LNA無論修飾哪個(gè)堿基，其作用都是相近的。這些結(jié)果顯示，LNA修飾的探針可以提高雜交雙鏈的穩(wěn)定性。 7、LNA：DNA錯(cuò)配堿基對(duì)的熱穩(wěn)定性 LNA：DNA錯(cuò)配對(duì)雙鏈穩(wěn)定性的破壞作用要大于DNA：DNA錯(cuò)配。其中C：c和C：t錯(cuò)配是所有LNA：DNA錯(cuò)配中最不穩(wěn)定的堿基對(duì)，而c：c和c：t錯(cuò)配是所有DNA：DNA錯(cuò)配中最不穩(wěn)定的堿基對(duì)，T：g和t：g對(duì)雙鏈

12、穩(wěn)定性破壞的作用是最小的。并且N：m錯(cuò)配和n：M錯(cuò)配對(duì)雙鏈穩(wěn)定性破壞的作用有很大的不同。 8、含有一個(gè)LNA：DNA互補(bǔ)堿基對(duì)和一個(gè)DNA：DNA錯(cuò)配堿基對(duì)的雙鏈的熱穩(wěn)定性 隨著錯(cuò)配位點(diǎn)逐漸靠近雙鏈的末端，錯(cuò)配對(duì)雙鏈穩(wěn)定性的破壞作用逐漸減弱；另外，雙鏈穩(wěn)定性主要取決于錯(cuò)配堿基對(duì)的類型，而與錯(cuò)配距LNA：DNA互補(bǔ)堿基對(duì)的距離無明顯關(guān)系。 9、靶標(biāo)鏈上發(fā)生單堿基插入時(shí)LNA—DNA雙鏈的穩(wěn)定性 若對(duì)雜交雙鏈

13、進(jìn)行單個(gè)堿基的LNA修飾，當(dāng)雙鏈發(fā)生單堿基插入時(shí)，插入對(duì)LNA—DNA雙鏈穩(wěn)定性的破壞作用要大于DNA—DNA雙鏈，說明LNA堿基對(duì)插入的識(shí)別能力高于DNA堿基。LNA堿基修飾鳥嘌呤比修飾胞嘧啶時(shí)，對(duì)插入的識(shí)別能力更強(qiáng)。 10、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PCR上游引物的3’末端經(jīng)LNA修飾后，若3’末端與模板不是互補(bǔ)的，則PCR擴(kuò)增效率明顯降低，即LNA修飾的引物其識(shí)別錯(cuò)配的能力與DNA引物相比大大提高。普通PCR實(shí)驗(yàn)也

14、證明LNA引物可產(chǎn)生較少的錯(cuò)配產(chǎn)物，而DNA引物與模板發(fā)生錯(cuò)配時(shí)卻有大量的錯(cuò)誤產(chǎn)物擴(kuò)增出。 結(jié)論： 1、不同類型的堿基錯(cuò)配其穩(wěn)定性各不相同，其順序?yàn)椋篏：T>G：G>G：A>A：A>或≈T：T>或≈A：C>T：C>C：C。 2、堿基錯(cuò)配發(fā)生在中間比發(fā)生在兩端對(duì)雙鏈的穩(wěn)定性具有更大的破壞效應(yīng)。 3、堿基插入與堿基錯(cuò)配對(duì)雙鏈穩(wěn)定性的破壞作用相似。 4、LNA修飾的寡核酸探針不僅可顯著提高雜交雙鏈穩(wěn)定性

15、，還可以提高雙鏈特異性。 5、LNA修飾嘌呤堿基時(shí)，其識(shí)別錯(cuò)配的能力高于DNA堿基和LNA修飾嘧啶堿基。 6、隨著錯(cuò)配位點(diǎn)逐漸靠近雙鏈的末端，錯(cuò)配對(duì)雙鏈穩(wěn)定性的破壞作用逐漸減弱；另外，雙鏈穩(wěn)定性主要取決于錯(cuò)配堿基對(duì)的類型，而與錯(cuò)配距LNA：DNA互補(bǔ)堿基對(duì)的距離無明顯關(guān)系。 7、LNA堿基對(duì)插入的識(shí)別能力高于DNA堿基；LNA堿基修飾鳥嘌呤比修飾胞嘧啶時(shí)，對(duì)插入的識(shí)別能力更強(qiáng)。 8、PCR引物的3’末端經(jīng)