miR-29c在鵝肥肝形成中的表達(dá)與功能研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要通過與靶基因的3'UTR區(qū)結(jié)合使靶基因的mRNA翻譯受到抑制或直接降解，從而調(diào)控發(fā)育、代謝和癌癥等生物過程，是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。肝臟是脂肪酸合成的主要場所，在動物的脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29c可以調(diào)控肝臟的纖維化，并且在抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。然而，在脂肪肝形成過程中miR-29c的表達(dá)與調(diào)控以及其功能尚不清

2、楚。本實驗對此進(jìn)行較深入的研究，主要結(jié)果如下:
　　1、填肥抑制了miR-29c在肝臟、胸肌和腹脂中的表達(dá)。本研究利用實時熒光定量技術(shù)測定了填肥朗德鵝與對照朗德鵝（常規(guī)飼養(yǎng)）胸肌、腹脂和肝臟中的miR-29c表達(dá)水平。結(jié)果顯示，填肥顯著抑制了這些與脂肪代謝相關(guān)組織中的miR-29c的表達(dá)，提示其在鵝肝臟脂肪代謝過程中扮演重要角色。
　　2、miR-29c的靶基因預(yù)測與篩選。依據(jù)雞鵝miR-29c種子序列的保守性，參考雞的基因

3、組序列，利用生物信息學(xué)軟件miRDB、TargetScan、和Microcosm預(yù)測miR-29c的靶基因，兩兩取交集并參考已有文獻(xiàn)篩選得到COL3A1、SGK1、INSIG1、DDX3X、PPM1D、TNFAIP3共6個靶基因。然后，通過對預(yù)測靶基因的定量驗證發(fā)現(xiàn)COL3A1、SGK1、INSIG1三個靶基因在填飼后朗德鵝肝臟中的表達(dá)量顯著上調(diào)，DDX3X、PPM1D、TNFAIP3的表達(dá)則未出現(xiàn)顯著上調(diào)。依據(jù)miRNA通常與其靶基因

4、表達(dá)量相反，我們推定COL3A1、SGK1和INSIG1最有可能是miR-29c靶基因。
　　3、miR-29c的靶基因驗證。首先，設(shè)計候選靶基因3'UTR序列特異性引物進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)克隆測序獲得擴增產(chǎn)物的序列。再利用pMIR-REPORT分別構(gòu)建靶基因3'UTR靶序列區(qū)的表達(dá)載體，同時依據(jù)獲得的鵝miR-29c成熟序列設(shè)計其模擬物用于靶向關(guān)系的驗證。最后，通過在非肝細(xì)胞系CHO中建立的雙熒光素酶系統(tǒng)驗證鵝miR-29c的三個

5、靶基因。結(jié)果表明COL3A1、SGK1和INSIG1為鵝miR-29c的靶基因。因此，miR-29c可能通過對這些基因的作用影響鵝肥肝的形成。
　　4、在鵝原代肝細(xì)胞中miR-29c對靶基因表達(dá)的影響。通過設(shè)置miR-29c過表達(dá)組、抑制組以及相應(yīng)的對照組，經(jīng)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，以及靶基因COL3A1、SGK1、INSIG1的定量檢測，發(fā)現(xiàn)COL3A1和INSIG1的表達(dá)在鵝原代肝細(xì)胞中受到miR-29c的調(diào)控，而SGK1的表達(dá)受mi

6、R-29c的調(diào)控可能為肝細(xì)胞中的其他因子所干擾。miR-29c對COL3A1和INSIG1表達(dá)的影響更容易在miR-29c表達(dá)受到抑制時發(fā)生。
　　5、脂肪肝形成相關(guān)因子處理鵝肝細(xì)胞對miR-29c表達(dá)的影響。本研究利用不同濃度的葡萄糖、胰島素、脂肪酸分別處理鵝肝細(xì)胞以檢測對miR-29c表達(dá)的影響，結(jié)果顯示100mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L棕櫚酸鉀均可顯著降低miR-29c的表達(dá)，但100 nmol/L胰島素和0.5m

7、mol/L油酸鈉對miR-29c表達(dá)的影響甚少。說明高糖、高脂均可以誘導(dǎo)鵝肥肝中miR-29c的表達(dá)，進(jìn)一步說明miR-29c的表達(dá)受鵝脂肪肝形成相關(guān)因子的調(diào)控。
　　6、miR-29c介導(dǎo)葡萄糖對鵝肝細(xì)胞中靶基因INSIG1、COL3A1的調(diào)控。本實驗對鵝原代肝細(xì)胞進(jìn)行miR-29c抑制劑轉(zhuǎn)染和葡萄糖處理，并定量檢測靶基因COL3A1、INSIG1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，100 mmol/L的葡萄糖能使INSIG1的表達(dá)顯著上調(diào)，

8、miR-29c抑制劑能顯著增強這種趨勢，而100 mmol/L的葡萄糖能使COL3A1的表達(dá)顯著下調(diào)，但miR-29c抑制劑能顯著抑制這種下調(diào)。這說明葡萄糖誘導(dǎo)的INSIG1和COL3A1的表達(dá)受到miR-29c的調(diào)控。
　　7、miR-29c的上游轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及初步驗證。首先設(shè)計miR-29c上游序列引物進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)克隆測序獲得上游序列。然后，通過Gene Regulation在線軟件對鵝miR-29c的上游序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因