海馬低頻電刺激對KA點燃大鼠GABAA受體α1和β2亞基表達的影響.pdf

1、目的：
　　研究海馬低頻電刺激（LFS）對海人酸致癲癇大鼠海馬突觸內GABAA受體α1和β2亞基表達的影響，了解LFS對難治性癲癇的治療機制。
　　材料和方法：
　　6-8周齡雄性SD大鼠，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體重250～280g，單籠飼養(yǎng)，晝夜循環(huán)。按隨機數(shù)字表法分為癲癇組、假手術組、治療組和空白對照組，每組n=10只：（1）癲癇組：立體定向下將海人酸（KA）注射至左側海馬CA3區(qū)（坐標：前囟后5.0mm

2、，旁開4.8mm，深度4.8mm）建立KA點燃模型；（2）假手術組：KA點燃后只在右側海馬植入電極而不進行LFS；（3）LFS治療組：KA點燃后在右側海馬植入電極，通過A-M SYSTEMS2100刺激器進行LFS。刺激參數(shù)為：脈沖雙向方波，累計時間30分鐘，波寬lms，強度100μA，頻率1Hz，每天固定時間刺激1次，連續(xù)2周。（4）空白對照組不予任何處理。實驗開始后觀察點燃大鼠行為學表現(xiàn)和監(jiān)測腦電圖；實驗結束后，一部分大鼠斷頭取腦，

3、剝離出海馬組織凍存；另一部分大鼠活體灌注行石蠟包埋。通過尼氏染色檢測大鼠海馬神經元損傷情況；通過RT-PCR檢測海馬α1和β2亞基mRNA表達情況；通過免疫組化和Western-Blot檢測海馬α1和β2亞基蛋白表達情況。應用統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊性檢驗后組間差異統(tǒng)計學意義比較采用LSD-t檢驗，以p≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.動物模

4、型的行為學表現(xiàn)：注射海人酸后大鼠最初表現(xiàn)為抖須、閉眼、流涎、面肌痙攣、節(jié)律性的咀嚼，隨后出現(xiàn)濕狗樣抖動、前肢上抬、抽搐隨即跌倒，發(fā)作劇烈者，可出現(xiàn)突然跳躍，不停旋轉。
　　2.腦電圖：KA致癇后典型的癲癇波型有單棘波、多相棘波、雙相棘波、棘-慢波、陣發(fā)性高幅尖波節(jié)律，期間有發(fā)作性后抑制，其中以多發(fā)棘波為主且頻繁出現(xiàn)。
　　3.尼式染色：癲癇組、假手術組、治療組海馬CA1區(qū)神經元排列松散、紊亂、缺失嚴重，輪廓不清，胞核結構模糊

5、，核仁不明顯，甚至消失。空白對照組CA1區(qū)神經元細胞形態(tài)清晰，排列整齊，胞核結構清晰，胞漿中可見尼式小體，神經元未見異常形態(tài)改變。說明海馬LFS治療不能逆轉受損傷的神經元。
　　4.RT-PCR：TRIzol法提取海馬組織總RNA，RT-PCR儀分析mRNA表達變化情況。結果顯示α1亞基在癲癇組、假手術組、治療組和空白對照組中的相對表達倍數(shù)為0.32±0.21、0.35±0.18、3.81±0.33、4.23±0.16；β2亞基為

6、0.49±0.22、0.52±0.25、2.08±0.30、2.44±0.19。癲癇組、假手術組與治療組、空白對照組之間α1亞基、β2亞基表達的差異有統(tǒng)計學意義（p﹤0.01）；癲癇組與假手術組（p﹥0.05），及治療組與空白對照組之間α1和β2亞基表達的差異無統(tǒng)計學意義（p﹥0.05）。
　　5.免疫組織化學：神經元胞漿呈棕黃色為陽性。α1亞基平均吸光密度（IA）值法在癲癇組、假手術組、治療組與空白對照組分別表達量：0.09±0

7、.02、0.10±0.02、0.21±0.03、0.24±0.01；β2亞基分別為：0.06±0.02、0.07±0.03、0.15±0.02、0.18±0.04。癲癇組、假手術組與治療組、空白對照組之間α1、β2亞基表達的差異有統(tǒng)計學意義（p﹤0.05），但癲癇組與假手術組（p﹥0.05），以及治療組與空白對照組之間α1、β2亞基表達的差異無統(tǒng)計學意義（p﹥0.05）。提示海馬LFS能使癲癇大鼠GABAA受體α1及β2亞基表達上調。<

8、br>　　6.Western-Blot：Gel-Pro analyzer凝膠成像分析軟件計算出相對灰度值；可見α1亞基在癲癇組、假手術組、治療組和空白對照組的相對灰度值為：0.29±0.03、0.21±0.07、0.65±0.17、0.79±0.15；β2亞基為0.16±0.09、0.18±0.02、0.53±0.06、0.66±0.15。治療組α1和β2亞基蛋白表達量較癲癇組和假手術組明顯升高，但仍低于正常水平。癲癇組、假手術組與治療