反義策略阻斷外排泵出系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)多重耐藥銅綠假單胞菌及耐氟喹諾酮類大腸埃希桿菌耐藥性的研究.pdf

1、背景與目的：
　　銅綠假單胞菌和大腸埃希桿菌是引起臨床感染性疾病較常見(jiàn)的致病菌。由于抗生素的長(zhǎng)期大量使用，特別是不規(guī)范地濫用抗生素，導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，細(xì)菌耐藥可導(dǎo)致患者感染率增加，感染持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，不恰當(dāng)治療增加，住院時(shí)間延長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用增加，甚至死亡率上升。多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)有較高的感染率和病死率，是導(dǎo)致燒傷病人死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在我國(guó)耐喹諾酮類大腸埃希桿菌(FREC)的耐藥率處于全球前列，給臨床

2、治療疾病帶來(lái)困難，也給醫(yī)院感染控制提出了嚴(yán)峻的問(wèn)題。因此，尋找一種新的控制MDR-PA及FREC感染的策略變得迫在眉睫。主動(dòng)泵出系統(tǒng)在MDR-PA及FREC的耐藥性產(chǎn)生方面起很關(guān)鍵的作用，MexAB-OprM是MDR-PA最主要的主動(dòng)泵出系統(tǒng)，無(wú)論是與MexAB共同起作用還是單獨(dú)起作用，由oprM基因編碼的外膜蛋白OprM對(duì)多重耐藥性的形成都起著非常重要的作用。AcrAB-TolC是大腸埃希桿菌的最主要的外排泵，AcrAB是決定細(xì)菌對(duì)氟

3、喹諾酮類藥物耐藥的重要機(jī)制。在本研究中我們以oprMmRNA和acrBmRNA為靶基因，設(shè)計(jì)合成選擇性針對(duì)oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs617)和針對(duì)acrBmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs831)，制備納米微粒脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)，并通過(guò)該遞藥系統(tǒng)分別將PS-ODNs617和PS-ODNs831轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入MDR-PA和FREC細(xì)菌內(nèi)，旨在通過(guò)阻斷MexAB-OprM和AcrAB-TolC主動(dòng)泵出系統(tǒng)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)

4、MDR-PA及FREC的耐藥性，恢復(fù)兩類致病菌對(duì)常用抗生素對(duì)的敏感性。
　　方法：
　　1.聚乙烯亞胺(PEI)-硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)納米微粒脂質(zhì)體的制備：以oprM和acrBmRNA為靶基因，設(shè)計(jì)合成針對(duì)oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs617)和針對(duì)acrBmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs831)。將25KDa鏈狀PEI與PS-ODNs通過(guò)靜電相互作用制備成荷正電荷的聚乙烯亞

5、胺-硫代寡聚脫氧核苷酸納米微粒(PEI-ODN納米微粒)，將蛋黃卵磷脂(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)以14:0.9:1摩爾比混合后，用薄膜分散法制備包裹PEI-ODN納米微粒脂質(zhì)體；用粒徑分析儀測(cè)定納米微粒和脂質(zhì)體的平均粒徑；用葡聚糖凝膠過(guò)濾法分離未被包封的PEI-ODN納米微粒和脂質(zhì)體；紫外法測(cè)A260nm值計(jì)算脂質(zhì)體包封率；通過(guò)體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估脂質(zhì)體穩(wěn)

6、定性。
　　2.選擇性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：用納米微粒脂質(zhì)體的方法將PS-ODNs617導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU)；測(cè)定PS-ODNs617對(duì)MDR-PA生長(zhǎng)的影響；測(cè)定給予PS-ODNs617后，不同抗生素對(duì)MDR-PA的最小抑菌濃度(MIC)的變化；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)PS-ODNs617對(duì)基因oprM表達(dá)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中PS-ODNs6

7、17設(shè)3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)、游離PEI組(5.5μg/ml)和游離PS-ODNs617組(100μg/ml)。
　　3．選擇性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆轉(zhuǎn)FREC耐藥性研究：用納米微粒脂質(zhì)體的方法將PS-ODNs831導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU)；測(cè)定

8、PS-ODNs831對(duì)FREC生長(zhǎng)的影響；測(cè)定給予PS-ODNs831后，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)FREC的最小抑菌濃度(MIC)的變化；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)PS-ODNs831對(duì)基因acrB表達(dá)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中PS-ODNs831設(shè)3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)、游離PEI組(5.5μg/ml

9、)和游離PS-ODNs831組(100μg/ml)。
　　結(jié)果：
　　1．PEI-ODN納米微粒脂質(zhì)體的制備：包裹PEI-ODN納米微粒的脂質(zhì)體的粒徑為(217.1±78.6)nm，平均包封率為(79.7?2.69)％。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，將脂質(zhì)體混懸液放置于4℃和室溫14d后，脂質(zhì)體的載藥量分別為初始載藥量的76.32％和70.1％。將脂質(zhì)體混懸液放置于37℃2d后脂質(zhì)體的載藥量?jī)H為初始載藥量的61.69％，約40％的PS

10、-ODNs滲漏到脂質(zhì)體外，表明脂質(zhì)體在體內(nèi)37℃時(shí)有較好的釋藥率，可以緩慢將包裹的藥物釋放。
　　2.選擇性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組都能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上MDR-PA的生長(zhǎng)(P<0.01)，并隨著PS-ODNs617濃度的增加，抑制MDR-PA菌落生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組的哌拉西林都能顯

11、著抑制MDR-PA的生長(zhǎng)，并且具有濃度依賴性；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組都能使不同抗生素對(duì)MDR-PA的MIC值降低；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組能明顯抑制oprMmRNA的表達(dá)(P<0.01)，并具有濃度依賴性抑制效應(yīng)。游離PS-ODNs617組(100μg/ml)與空白對(duì)照組相比其作用比較小，而空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)和游

12、離PEI組(5.5μg/ml)與空白對(duì)照組相比，其對(duì)MDR-PA的CFU、生長(zhǎng)測(cè)定、MIC和oprMmRNA的表達(dá)均沒(méi)有明顯的影響。
　　3.選擇性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組都能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上MDR-PA的生長(zhǎng)(P<0.01)，并隨著PS-ODNs831濃度的增加，抑制FREC菌落生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs

13、831)的四個(gè)劑量組的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星都能顯著抑制FREC的生長(zhǎng)，并且具有濃度依賴性；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組都能使環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)FREC的MIC值降低至敏感；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組能明顯抑制acrBmRNA的表達(dá)(P<0.01)，并具有濃度依賴性抑制效應(yīng)。游離PS-ODNs831組(100μg/ml)與空白對(duì)照組相比其作用比較小，而空白脂質(zhì)體組、隨

14、機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)和游離PEI組(5.5μg/ml)與空白對(duì)照組相比，其對(duì)FERC的CFU、生長(zhǎng)測(cè)定、MIC和acrBmRNA的表達(dá)均沒(méi)有明顯的影響。
　　結(jié)論：
　　1．本研究制備的納米微粒脂質(zhì)體載藥量大、包封率高、穩(wěn)定性好，可以有效將硫代寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到銅綠假單胞菌和大腸埃希桿菌菌體內(nèi)。
　　2．抗oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸能夠選擇性抑MDR-PA細(xì)菌體內(nèi)MexAB-